Жаңалықтар

Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз пайдаланып жатқан шолғыш нұсқасында шектеулі CSS қолдауы бар.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Әзірше, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Қатерлі ісік жасушалары жасушалық стрессті жеңу және ілгерілеуді жалғастыру үшін әртүрлі механизмдерді дамытты.Протеинкиназа R (PKR) және оның ақуыз активаторы (PACT) жасуша пролиферациясын және апоптозды тежеуге әкелетін әртүрлі стресс сигналдарын бақылайтын бастапқы жауап берушілер болып табылады.Дегенмен, рак клеткаларындағы PACT-PKR жолының реттелуі негізінен белгісіз болып қалады.Мұнда біз ұзақ кодталмаған РНҚ (lncRNA) аспартил тРНҚ синтетаза антисенс РНҚ 1 (DARS-AS1) PACT-PKR жолының тежелуіне тікелей қатысатынын және рак клеткаларының көбеюіне ықпал ететінін анықтадық.CRISPRi 971 қатерлі ісікке байланысты lncRNA-ның кең ауқымды функционалды скринингін пайдалана отырып, біз DARS-AS1 ісік жасушаларының пролиферациясының едәуір жоғарылауымен байланысты екенін анықтадық.Сондықтан, DARS-AS1 нокауты жасуша пролиферациясын тежейді және in vitro түрлі рак жасушаларының желілерінде рак клеткаларының апоптозына ықпал етеді және in vivo ісік өсуін айтарлықтай төмендетеді.Механикалық түрде DARS-AS1 PACT белсендіру доменімен тікелей байланысады және PACT-PKR өзара әрекеттесуіне жол бермейді, осылайша PKR активациясын, eIF2α фосфорлануын азайтады және апоптотикалық жасушалардың өлімін тежейді.Клиникалық түрде DARS-AS1 көптеген қатерлі ісіктерде кеңінен көрінеді және бұл lncRNA-ның шамадан тыс экспрессиясы нашар болжамды көрсетеді.Бұл зерттеу DARS-AS1 lncRNA арқылы PACT-PKR жолының қатерлі ісікке спецификалық реттелуін түсіндіреді және қатерлі ісік болжамы мен емдеуінің басқа мақсатын ұсынады.
Стресске бейімделу қабілеті рак клеткаларының өмір сүруі мен көбеюінің маңызды сипаттамасы болып табылады.Қатал микроорталарда - қоректік заттардың жетіспеушілігі, гипоксия және төмен рН - қатерлі ісіктің жылдам таралуы және метаболикалық белгілері жасушалардың өлімі туралы сигнал беру жолдарын тудыруы мүмкін.Қатерлі ісік ауруында p535, жылу соққысының ақуыздары 6, 7, KRAS8, 9 және HIF-110, 11, 12, 13 сияқты стресске сезімтал гендердің реттелуінің бұзылуы жиі байқалады, осылайша апоптозды блоктайды және өмір сүруге ықпал етеді.
Протеинкиназа R (PKR) маңызды стресс сенсоры және эукариоттық инициация факторы 2α (eIF2α) суббірлігінің киназасы, жасушалық стрессті жасуша өлімімен байланыстыратын трансляциялық реттегіш.PKR бастапқыда бөгде қос тізбекті РНҚ (dsRNA) анықтау арқылы вирусқа қарсы ақуыз ретінде анықталды.Белсендірілгеннен кейін PKR вирустық және жасушалық ақуыз синтезін тежеу ​​үшін eIF2α фосфорлайды14,15,16.PACT (PKR активатор протеині) dsRNA17,18,19,20,21,22,23 болмаған кезде бірінші PKR активатор ақуызы ретінде анықталды.PKR-мен тікелей өзара әрекеттесу арқылы PACT әртүрлі кернеулерді (сарысудың аштығы, пероксид немесе арсенитпен өңдеу) PKR және төменгі ағынды сигнал беру жолдарына ауыстырады.eIF2α фосфорлануымен қатар, PACT-делдалдық PKR белсендіру стресс-жауаппен байланысты әртүрлі оқиғаларды, соның ішінде PI3K/Akt24 жолы арқылы өзгертілген тотығу-тотықсыздану күйін, p5325,26 және NF-κB27,28 арқылы жақсартылған ДНҚ зақымдануын тексеруді қосады Транскрипцияны реттейді, 29. Стресске жауап берудегі, пролиферациядағы, апоптоздағы және басқа да негізгі жасушалық процестердегі маңызды рөлін ескере отырып, PKR және PACT көптеген аурулар, әсіресе қатерлі ісік30,31,32,33 үшін перспективті терапиялық мақсаттар болып табылады.Алайда, бұл плейотропты функционалдық және биологиялық маңыздылығына қарамастан, рак клеткаларындағы PACT/PKR белсенділігін реттеу қиын болып қалады.
lncRNAs - белокты кодтау потенциалы жоқ 200 нуклеотидтен үлкен транскрипттер.Тұтас геномды секвенирлеудің озық жобалары мыңдаған lncRNA-ны анықтағаннан бері,35,36 олардың биологиялық функцияларын түсіндіруге көп күш жұмсалды.Өсіп келе жатқан зерттеулер lncRNA көптеген биологиялық процестерге37 қатысатынын көрсетті, соның ішінде Х-хромосоманың инактивациясын38,39, импринтинг40, транскрипцияны41,42, трансляцияны43 және тіпті қатерлі ісік өсуі44,45,46,47 реттеу.Бұл зерттеулер көптеген lncRNAs PACT/PKR жолына қатысатынын хабарлады.Осындай зерттеулердің бірі lncRNA ASPACT PACT транскрипциясын тежейтінін және PACT мРНҚ ядросының сақталуын арттыратынын көрсетті.Басқа зерттеулер lncRNA nc886 PKR-мен байланысатынын және оның фосфорлануын тежейтінін көрсетті49,50.Әзірге PACT арқылы PKR белсендіруін реттейтін lncRNA хабарланбаған.
Аспартил-тРНҚ синтетаза антисенс РНҚ 1 (DARS-AS1) онкогенді lncRNA51,52,53,54 ретінде анықталды.miP-194-5p53, miP-12952 және miP-532-3p51 реттеуі арқылы DARS-AS1 сәйкесінше айқын жасушалы бүйрек жасушалы карциномасының, қалқанша безінің карциномасының және өкпенің ұсақ жасушалы емес карциномасының өсуіне ықпал ететіні көрсетілген.Тонг және оның әріптестері сонымен қатар DARS-AS1 протеин 39 (RBM39) РНҚ-байланыстыру мотивінің тұрақтылығын сақтау арқылы миелома прогрессиясына ықпал ететінін анықтады.Дегенмен, бұл lncRNA PACT-PKR белсендіруін реттеуге және рак клеткаларының стресстік реакциясына қатысатыны туралы зерттеулер жүргізілген жоқ.
Мұнда біз CRISPRi жүйесін пайдалана отырып кең ауқымды функцияны жоғалту экранын жасадық және DARS-AS1 lncRNA қатерлі ісік жасушаларының бірнеше түрлерінің көбеюіне ықпал ететінін анықтадық.Сонымен қатар, біз негізгі механизмді анықтадық: DARS-AS1 PACT-пен тікелей байланысады, PACT және PKR байланысуын тежейді, төменгі PKR субстраты eIF2α фосфорлануын болдырмайды және сайып келгенде апоптотикалық жасуша өлімін тежейді.Қорытындылай келе, біздің жұмысымыз DARS-AS1 lncRNA-ны PACT-PKR жолының реттеушісі және онкологиялық ауруларды емдеу мен болжау үшін әлеуетті мақсат ретінде ашады.
Кең ауқымды геномдық профильді зерттеулер қатерлі ісікке байланысты жүздеген lncRNA-ны анықтады.Дегенмен, олардың қызметі негізінен белгісіз болып қала береді56.Қатерлі ісіктің өршуіне қатысатын перспективалы lncRNA кандидаттарын анықтау үшін біз CRISPRi жүйесін пайдалана отырып, SW620 колоректальды қатерлі ісік жасушаларының желісіндегі пролиферацияны азайтуға арналған функцияны жоғалту экранын жасадық (сурет 1a).SW480 және SW620 тоқ ішек ісігі жасушаларының бірегей ерекшелігі олардың бір емделушідегі бастапқы және қайталама ісіктерден алынуы болып табылады.Бұл тоқ ішек қатерлі ісігінің прогрессиясындағы генетикалық өзгерістерді зерттеу үшін құнды салыстыруды қамтамасыз етеді.Сондықтан біз РНҚ секвенирлеуін қолдана отырып, колоректальды қатерлі ісік жасушаларының (SW480 және SW620) транскриптомдарын талдадық және жарияланған әдебиеттерден кейбір әлеуетті функционалдық lncRNA-ларды жинадық.Осы нәтижелерге сүйене отырып, біз теріс бақылауға арналған 971 қатерлі ісікпен байланысты lncRNA және 500 мақсатсыз сгРНҚ олиголарына бағытталған 7355 сгРНҚ олигосынан тұратын біріктірілген sgRNA кітапханасын жасадық (Қосымша деректер 1).
CRISPRi жүйесін пайдаланып скринингтің схемалық көрінісі.b скринингтен кейін sgRNA байыту.Көлденең нүктелі сызық log2 (бүктеудің өзгеруі) = ±0,58 білдіреді.Тік нүктелі сызық p мәнін = 0,05 көрсетеді.Қара нүктелер мақсатты емес sgRNA (NC ретінде белгіленген) білдіреді.Қызыл нүктелер DARS-AS1-ге бағытталған sgRNAs болып табылады.Көк нүктелер - LINC00205, бұрын сипатталған онкогенді lncRNA-ға бағытталған sgRNA.бүктеменің өзгеруі = (қалыпты көрсеткіш, 17 күн)/(қалыпты көрсеткіш, 0 күн).c DARS-AS1 sgRNA-ны бұзу жасуша өсуін тежеді.Қате жолақтары үш тәжірибенің ± стандартты ауытқуын білдіреді.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 екі жақты Студенттің t-тесті.d Ісіктерде DARS-AS1 экспрессиясы (TCGA деректер жинағы).em BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP және COAD (TCGA деректер жинағы) бар емделушілерден алынған жұпталған қалыпты және ісік үлгілеріндегі DARS-AS1 экспрессиясы.p-мәндері жұпталған екі жақты Студенттің t-тесті арқылы алынды.
Плазмиданы құрастырып, лентивирусты ораудан кейін біз төрт тәуелсіз инфекция экспериментінде dCas9-SW620 колоректальды қатерлі ісік жасушаларының желісін жоғарыда келтірілген кітапханамен ауыстырдық.Бұл инфекциялар үшін инфекцияның көптігі (MOI) 0,1-0,3 болды, бұл әрбір жасушаны тек бір сгРНҚ-мен трансфекциялауға болатынын көрсетеді.18 күн ішінде in vitro культурасынан кейін мақсатты sgRNAs байыту профилі скринингтен кейін төмендеді немесе жоғарылады, ал мақсатты емес бақылау олигонуклеотидтерінің саны скрининг алдындағы профильмен салыстырғанда салыстырмалы түрде өзгеріссіз қалды, бұл біздің нысананың жоғары скринингтік спецификалық екенін көрсетеді. кітапхана.Күріш.1b және қосымша кесте 1). Өкпенің қатерлі ісігі мен бауыр обырының өршуіне ықпал ететіні туралы бұрын хабарланған LINC0020558,59,60 скринингтен шығарылды (log2 (бүктеу) < -0,58, p мәні < 0,05), бұл скринингтің сенімділігін растайды (1б-сурет). Өкпенің қатерлі ісігі мен бауыр обырының өршуіне ықпал ететіні туралы бұрын хабарланған LINC0020558,59,60 скринингтен шығарылды (log2 (бүктеу) < -0,58, p мәні < 0,05), бұл скринингтің сенімділігін растайды (1б-сурет). LINC00205, егер ол бар болса, ол легких және рака печени58, 59, 60, осы уақыттан бастап прогрессивті прогреске ие болады (log2 (кратное изменение) <-0,58, белгілі бір p <0,05), 1b). LINC00205, бұрын өкпе обыры мен бауыр обыры58,59,60 өршуіне ықпал ететіні хабарланған, бұл скринингтің сенімділігін растайтын (log2 (бүктеудің өзгеруі) <-0,58, p-мәні <0,05) алынып тасталды (сурет .1b) . Link00205 之前 被 报道 报道 报道 报道 报道 报道 报道 报道 报道 报道 报道 报道 促进 肺癌 肺癌 肺癌 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 选 选 (log2 (倍数 变化) <-0.58, p 值 <0,05), 证实证实 <0.05), 证实 该 筛选 的 可靠性 (图 1B). Link00205 之前 被 报道 报道 报道 报道 报道 报道 报道 报道 报道 报道 报道 报道 促进 肺癌 肺癌 肺癌 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 进展 选 选 (log2 (倍数 变化) <-0.58, p 值 <0,05), 证实证实 <0.05), 证实 该 筛选 的 可靠性 (图 1B). LINC00205, егер ол жұмыс істемейді, ол 58, 59, 60 және печени58, 59, 60 прогресті қамтамасыз етеді (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), белгілі бір жерде 1b). LINC00205, бұрын өкпе және бауыр қатерлі ісігінің прогрессиясын 58,59,60 ілгерілететіні хабарланған, бұл скринингтің сенімділігін растайтын (log2 (қатпарлы өзгеріс) <-0,58, p-мәні <0,05) алынып тасталды (сурет .1b).
Сынақталған барлық lncRNA-лардың ішінде DARS-AS1 де скринингтен өтті, үш туыстық sgRNA олигонуклеотидтері 18 күннен кейін культурадан кейін айтарлықтай төмендеді, бұл осы lncRNA-ның жойылуы қатерлі ісік пролиферациясының төмендеуіне әкелді (сурет 1b).Бұл нәтиже DARS-AS1 нокдаун жасушаларының өсу жылдамдығы бақылау жасушаларымен салыстырғанда екі есе азайғанын (1c-сурет) және бірнеше басқа қатерлі ісік түрлерінің алдыңғы есептеріне сәйкес келетінін көрсететін колоректальды қатерлі ісік жасушаларында MTS талдауы арқылы одан әрі қолдау тапты.: айқын жасушалы бүйрек қатерлі ісігі, қалқанша безінің қатерлі ісігі және шағын жасушалы емес өкпенің қатерлі ісігі51,52,53,55.Дегенмен, колоректальды қатерлі ісік кезінде оның қызметі мен молекулалық механизмдері әлі зерттелмеген.Сондықтан біз одан әрі зерттеу үшін осы lncRNA таңдадық.
Пациенттердегі DARS-AS1 экспрессиясын зерттеу үшін біз қатерлі ісік геномының атласы (TCGA) жобасынан 10 327 ісік үлгісін жан-жақты талдадық.Біздің нәтижелеріміз DARS-AS1 әртүрлі ісіктердегі сау жасушаларда кеңінен экспрессияланғанын және айтарлықтай жоғары реттелетінін көрсетеді, соның ішінде тоқ ішек аденокарциномасы (COAD), бүйректің таза жасушалық карциномасы (KIRC) және бүйрек папиллярлы жасушалық карцинома (KIRP)..Өте аз (1d-сурет және қосымша 1а, б-сурет). Жұптасқан сау/ісік үлгілерін талдау қуықтың уротелиальды карциномасы (BLCA), бүйректің таза жасушалық карциномасы (KIRC), қуық асты безінің аденокарциномасы (PRAD), өкпенің жалпақ жасушалы карциномасы (LUSC) ісіктерінде DARS-AS1 айтарлықтай жоғары экспрессиясын растады. , жатыр корпусының эндометриялық карциномасы (UCEC), өкпе аденокарциномасы (LUAD), бауырдың гепатоцеллюлярлық карциномасы (LIHC), бүйректің бүйрек папиллярлы жасушалық карциномасы (KIRP) және тоқ ішек аденокарциномасы (COAD) (p мәні < 0,05) (1e–m-сурет) . Жұптасқан сау/ісік үлгілерін талдау қуықтың уротелиальды карциномасы (BLCA), бүйректің таза жасушалық карциномасы (KIRC), қуық асты безінің аденокарциномасы (PRAD), өкпенің жалпақ жасушалы карциномасы (LUSC) ісіктерінде DARS-AS1 айтарлықтай жоғары экспрессиясын растады. , жатыр корпусының эндометриялық карциномасы (UCEC), өкпе аденокарциномасы (LUAD), бауырдың гепатоцеллюлярлық карциномасы (LIHC), бүйректің бүйрек папиллярлы жасушалық карциномасы (KIRP) және тоқ ішек аденокарциномасы (COAD) (p мәні < 0,05) (1e–m-сурет) .Жұптасқан сау/ісік үлгілерін талдау қуықтың уротелиальды карциномасында (BLCA), мөлдір жасушалы бүйрек және бүйрек жасушалы карциномасында (KIRC), қуық асты безінің аденокарциномасында (PRAD), өкпенің жалпақ жасушалы карциномасында (LUSC) ісіктерінде DARS-AS1 айтарлықтай жоғары экспрессиясын растады., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) және аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05e)– м) . , жатыр денесінің эндометриялық карциномасы (UCEC), өкпенің аденокарциномасы (LUAD), бауырдың гепатоцеллюлярлық карциномасы (LIHC), бүйректің папиллярлы жасушалық карциномасы (KIRP) және тоқ ішектің аденокарциномасы (COAD) (p << 0,05) (1e– m-сурет) .. . <0,05）（图1e-m） .配 对 / 肿瘤样本 的 的 分析 分析 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 尿路 尿路 尿路 尿路 尿路 尿路 尿路 上 上 上 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 肾 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 (Prad), 细胞癌 细胞癌(LUSC) 肿瘤 的 的 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达显着 ((ucel) 肺腺癌 (LUAD) 肝肝 (lihc) 肾 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （коад） （p 值<0,05）（图1e-m） .Сау/ісік жұптастырылған үлгілерді талдау қуықтың уротелиальды карциномасында (BLCA), мөлдір жасушалы бүйрек жасушалы карциномасында (KIRC), простата аденокарциномасында (PRAD) және өкпенің жалпақ жасушалы карциномасында (LUSC) ісіктердегі DARS-AS1 рөлін одан әрі қолдады.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярлық карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярлық-клеточной карциноме (KIRP) және аденокарциноме толстой кишки (COAD) (0,15)e. -м). Жатырдың корпустық карциномасында (UCEC), өкпе аденокарциномасында (LUAD), гепатоцеллюлярлық карциномада (LIHC), бүйрек папиллярлы жасушалық карциномада (KIRP) және тоқ ішек аденокарциномасында (COAD) экспрессия (p мәні <0,05) (1e -m сурет).Біріктірілген бұл нәтижелер DARS-AS1 әртүрлі ісік ауруларында кеңінен және жоғары дәрежеде көрсетілгенін көрсетеді.
DARS-AS1 және DARS (антисенс тізбегін кодтайтын ген) бір промоторды ортақ пайдаланатындықтан және бір-бірінің жанында орналасқандықтан, біз DARS-ті емес, DARS-AS1-ді ыдырату үшін shRNA-ны жасадық (Қосымша 2a,b және қосымша кесте 2) .SW620-ден басқа, біз shRNA-ны бұзудың тиімділігі мен қызметін зерттеу үшін DARS-AS1 жоғары экспрессиялы басқа үш жасуша желісін де қолдандық (қосымша кесте 3).Біздің нәтижелеріміз әзірленген барлық үш shRNA кем дегенде 80% DARS-AS1 тітіркену тиімділігіне қол жеткізіп, DARS mRNA мөлшеріне аз әсер ететінін көрсетті (Қосымша 2c-f сурет).Сонымен қатар, біз DARS-AS1-ді осы shRNA-мен нокдаулау SW620 (49,7%) және HCT116 (27,7%), сүт безі қатерлі ісігінің жасушалық желісі MBA-MD-231 (53,4%) колоректальды қатерлі ісік жасушаларының жасушаларының өсуін айтарлықтай тежейтінін анықтадық.) және HepG2 гепатомасының жасушалық желісі (92,7% қысқарту), сондай-ақ олардың анкорсыз сфераларды құру қабілеті (әр жасуша линиясына орташа азаю ~50,8%, 44,6%, 40,7% және 75,7%) (2а,б-сурет).SW620-де колония түзілу талдауының нәтижелері DARS-AS1 shRNA орташа есеппен шамамен 69,6% төмендеуімен жасуша пролиферациясын айтарлықтай тежейтінін растады (Cурет 2c).
Бақылау shRNA және DARS-AS1 shRNA-ның SW620, HCT116, MBA-MD-231 және HepG2 жасушаларында жасуша пролиферациясына (a) және сфероидты түзуге (b) әсері.c Бақылау shRNA және DARS-AS1 shRNA-ның SW620 жасушаларында колония түзілуіне әсері.DARS-AS1 шамадан тыс экспрессиялайтын SW620 жасушаларының жасуша пролиферациясы (d), сфероидты түзілуі (e) және колония түзілуі (f).Көрсетілген деректер үш тәжірибенің орташа ± стандартты ауытқуы болып табылады.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 және *** p ≤ 0,001 екі жақты Студенттің t-тесті бойынша.
Функцияның жоғалуы бойынша зерттеулерді толықтыру үшін біз DARS-AS1 шамадан тыс экспрессиялайтын SW620 жасушаларын жасадық (Қосымша 2g сурет).DARS-AS1 шамадан тыс экспрессиясы SW620 жасушаларында жасушаның өсуін (1,8 есе), анкорсыз сфероидты түзуді (1,4 есе) және колония түзілуін (3,3 есе) айтарлықтай арттырды (2d-f-сурет).Біз бұл нәтижені басқа DARS-AS1 экспрессивті ұяшық сызығы, A549 арқылы растадық.DARS-AS1 шамадан тыс экспрессиясына байланысты бұл күшейтілген жасуша пролиферациясы одан әрі A549 жасушаларында байқалды (Қосымша 2h, i-сурет және қосымша 3-кесте).Біріктірілген бұл табыс пен жоғалту зерттеулері DARS-AS1 in vitro рак клеткаларының көбеюіне ықпал ететінін көрсетеді.
DARS-AS1 жасуша пролиферациясын реттейтін негізгі механизмді зерттеу үшін біз оның ақуызды байланыстыратын әлеуетті серіктестерін анықтау үшін РНҚ-ны төмен түсіру талдауын жасадық.RT-qPCR нәтижелері DARS-AS1 шамамен 86,2% SW620 жасушаларының цитоплазмасында орналасқанын көрсетті (қосымша 3a сурет).In vitro транскрипцияланған биотинилденген DARS-AS1 немесе псевдоРНҚ кейін SW620 жасуша лизаттарымен инкубацияланды, содан кейін SDS-PAGE бөлінді.Кейінгі күміс бояу DARS-AS1 тарту үлгілерінде ерекше жолақ (~38 кДа) айтарлықтай байытылғанын көрсетті, бірақ жалған РНҚ немесе моншақ үлгілерінде емес (Cурет 3a).Бұл жолақ масс-спектрометрия (MS) арқылы PKR белсендіретін ақуыз (PACT) ретінде анықталды және одан әрі SW620, HCT116 және HepG2 жасуша желілерінде иммуноблоттау арқылы расталды (3a, b-сурет).DARS және онымен байланысты PACT протеиндерін - PKR және TRBP - байыту сонымен қатар Western Blotting (WB) арқылы РНҚ талдауы арқылы зерттелді.Нәтижелер DARS-AS1 РНҚ мен осы үш ақуыз арасында тікелей әрекеттесу табылмағанын көрсетті (қосымша сурет 3b).DARS-AS1 және PACT арасындағы нақты өзара әрекеттесу РНҚ иммунопреципитациясының (RIP) талдауы арқылы одан әрі расталды, ол DARS-AS1 анти-ПАКТ антиденелерімен айтарлықтай байытылғанын, бірақ басқа бақылау РНҚ-ларында емес екенін көрсетті (3c-сурет).DARS-AS1 басқа жасушалық компоненттер болмаған кезде PACT-пен тікелей әрекеттесетінін анықтау үшін тазартылған PACT көмегімен in vitro биоқабатты интерферометрия (BLI) талдауы орындалды.Биотинмен таңбаланған DARS-AS1 немесе жалған РНҚ стрептавидин (SA) биосенсорларында иммобилизацияланды, содан кейін құрамында 1 мкм PACT бар кинетикалық буферде инкубацияланды.Атап айтқанда, PACT DARS-AS1 (KD мәні ~26,9 нМ) қатты байланысқан, бірақ РНҚ-ға еліктемейді (3d-сурет).Біріктірілген бұл нәтижелер DARS-AS1 және PACT арасындағы тікелей өзара әрекеттесу мен жоғары жақындықты көрсетеді.
РНҚ тарту талдауы SW620 жасушаларында PACT-пен әрекеттесетін DARS-AS1-ді анықтады.Жоғарыда байланысты ақуыздардың күміс бояуы.Төменгі иммуноблоттар анти-ПАКТ антиденелерімен орындалды.b РНҚ төмен түсіру талдауы HCT116 (жоғарғы) және HepG2 (төменгі) жасушаларында орындалды.PACT байыту иммуноблотинг арқылы анықталды.cRNA иммунопреципитациясының (RIP) талдаулары көрсетілген антиденелерді пайдаланып SW620 жасушаларында орындалды.d Толық ұзындықтағы DARS-AS1 немесе бақылау РНҚ-ға PACT байланыстыру қисықтары биоқабатты интерферометрия (BLI) арқылы алынды.РНҚ стрептавидин биосенсорында иммобилизацияланды.Байланысты өлшеу үшін 1 мкм PACT пайдаланылды.e РНҚ тарту талдауы биотинделген толық ұзындықтағы DARS-AS1 немесе кесілген (жоғарғы) көмегімен орындалды.PACT алынғанын көрсететін иммуноблот (төменгі).f Тазартылған жалаушаланған PACT биотинизацияланған толық ұзындықтағы DARS-AS1 инкубацияланды немесе in vitro RIP талдауы үшін кесілген (e-дегідей).Алынған РНҚ RT-qPCR арқылы тексерілді.g Әртүрлі РНҚ фрагменттерінің PACT үшін салыстырмалы жақындығы биоқабат интерферометриясы арқылы алынды.Талдау үшін 100 нМ РНҚ және 1 мкм RAST пайдаланылды.h In vitro RIP талдаулары тазартылған бүтін немесе кесілген таңбаланған PACT көмегімен орындалды.Алынған РНҚ RT-qPCR арқылы тексерілді.i DARS-AS1, PACT немесе екеуін де шамадан тыс білдіретін SW620 жасушаларының өсу жылдамдығы.j SW620 жасушаларында толық ұзындықты немесе кесілген DARS-AS1 шамадан тыс экспрессиясы жасуша өсуіне әртүрлі әсер етті.k Апоптоз анти-PARP антиденелерімен иммуноблоттау арқылы анықталды.l DARS-AS1 нокауты ағындық цитометрия арқылы көрсетілгендей SW620 жасушаларының апоптозын тудырады.Көрсетілген деректер үш тәжірибенің орташа ± стандартты ауытқуы болып табылады. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, екі жақты Студенттің t сынағы арқылы. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, екі жақты Студенттің t сынағы арқылы. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 екі жақты Студенттің t-тесті бойынша. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 екі жақты Студенттің t-тесті бойынша.
Содан кейін біз PACT қауымдастығы үшін қажетті DARS-AS1 аймағын анықтау үшін in vitro транскрипциясы арқылы үш биотинленген DARS-AS1 РНҚ фрагменттерін жасадық (3e-сурет).РНҚ талдауының нәтижелері әрбір фрагменттің PACT-пен әрекеттесе алатынын көрсетті, бірақ 3′-терминалды аймақ (A3 таңбаланған 384-768 нуклеотид) A1 таңбаланған 1-384 нуклеотидтен астамын көрсетті (3e-сурет).Ұқсас нәтижелер рекомбинантты PACT көмегімен in vitro RIP талдауында байқалды (3f-сурет).Осы нәтижелерге сәйкес, BLI көмегімен иммобилизацияланған РНҚ фрагменттерін PACT-пен байланыстыру эксперименттері де PACT-тың A3 (384–768 nt) (KD мәні шамамен 94,6 нМ) үшін жоғары жақындығы бар екенін, ал басқа аймақтармен дерлік байланысы жоқ екенін көрсетті.(3d-сурет).
Біз сондай-ақ PACT-тағы байланыстырушы аймақтарды қарастырдық.PACT құрамында үш функционалды домен бар, олардың екеуі сақталған қос тізбекті РНҚ байланыстыратын домендер (dsRBD) және ақуыз өзара әрекеттесуінің активаторы ретінде әрекет ететін үшінші домен (D3 белгіленген).Әрбір доменнің lncRNA байланыстыру қабілетін зерттеу үшін біз үш доменнің әрқайсысын жойып, in vitro RIP талдауын орындайтын үш мутацияны құрастырдық.Біздің нәтижелеріміз көрсеткендей, PACT үшінші доменінің (D3) жойылуы оның DARS-AS1-мен өзара әрекеттесуін (бұзылған PACT-пен салыстырғанда 0,11 есеге) басқа екі мутациямен салыстырғанда (3h-сурет) айтарлықтай төмендетеді, бұл шығарылымның төмендеуі көрсетілді. D3 DARS-пен әрекеттесті.-AC1.Біріктірілген бұл нәтижелер DARS-AS1 және PACT арасындағы өзара әрекеттесу негізінен DARS-AS1 3′ соңы және PACT D3 домені арқылы болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Біз DARS-AS1 PACT экспрессиясына және PACT DARS-AS1-ге әсер етпейтінін атап өттік (қосымша 3c сурет).Содан кейін біз PACT нокдаунының жасуша өсуіне әсерін зерттедік.DARS-AS1-тен айырмашылығы, PACT құлаған кезде салыстырмалы жасушалар 1,5-3 есе жылдам өсті (Қосымша 3d сурет).Колония түзу талдауының нәтижелері PACT көмегімен shRNA өңдеуден кейін жасушалар 2-3 еселенген колониялар түзгенін көрсетті (қосымша 3e сурет).DARS-AS1 PACT арқылы жасуша пролиферациясын реттейтінін тексеру үшін PACT, DARS-AS1 немесе екеуін де шамадан тыс экспрессиялайтын SW620 жасушаларын жасадық.PACT шамадан тыс экспрессиясы жасуша пролиферациясының айтарлықтай тежелуін көрсетті (3i-сурет).DARS-AS1 шамадан тыс экспрессиясы өз бетінше жасуша пролиферациясына айтарлықтай ықпал еткенімен, DARS-AS1 және PACT шамадан тыс экспрессиялайтын жасушалардың өсу жылдамдығында айтарлықтай айырмашылық болмады.Бұл нәтижелер PACT DARS-AS1 шамадан тыс экспрессиясынан туындаған өскен пролиферацияға қарсы тұруы мүмкін екенін көрсетеді.
DARS-AS1 әртүрлі аймақтарының PACT байланыстыру қабілеті әртүрлі болғандықтан, біз DARS-AS1 фрагменттерінің әртүрлі шамадан тыс экспрессиясы арқылы олардың жасуша пролиферациясына салыстырмалы әсерін зерттедік.Басқа екі фрагментпен салыстырғанда, DARS-AS1 жасуша пролиферациясын ынталандырудың ең жоғары қабілетіне ие DARS-AS1-дегі PACT-қа қатысты негізгі аймақ болып табылатын 3′ соңында (384-768 nt) шамадан тыс экспрессияланды (3j-сурет).Бұл нәтижелер DARS-AS1 байланыстыру қабілеті мен биологиялық функциясы арасындағы оң корреляцияны көрсетеді.
PACT про-апоптотикалық протеин болып табылады19.Сондықтан біз DARS-AS1 апоптозға әсерін зерттедік.Күтілгендей, DARS-AS1 нокдауы SW620 жасушаларында PARP бөлінуін айтарлықтай арттырды және SW620, HCT116, HepG2 және MBA-MD-231 жасуша желілеріндегі анексин V-оң жасушаларының үлесін арттырды (3k-сурет).3).3f-h), бұл DARS-AS1 рак клеткаларындағы апоптозға қарсы әсері PACT-тың апоптозды индукциялау функциясына қарама-қайшы екенін көрсетеді.Біріктірілген бұл нәтижелер DARS-AS1 онкогендік функциясының механизмі PACT функциясын тежеу ​​арқылы болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Содан кейін біз DARS-AS1-PACT қауымдастығының функционалдық салдарын зерттедік.PACT тікелей өзара әрекеттесу арқылы PKR белсендіреді, ол кейіннен eIF2α фосфорлануын күшейтіп, трансляциялық делеция мен апоптозды тудырады17.Біріншіден, біз DARS-AS1 PACT және PKR жасушалық локализациясына әсер ететінін зерттедік.Конфокальды флуоресценциялық микроскопия PACT және PKR орташа Пирсон корреляция коэффициенті 0,72 болатын SW620 жасушаларында жоғары коллокализацияланғанын көрсетті.Сонымен қатар, DARS-AS1 шамадан тыс экспрессиясы PACT және PKR колокализациясын айтарлықтай төмендетті (орташа Пирсон корреляция коэффициенті 0,61) (4а-сурет).DARS-AS1 PACT-PKR өзара әрекеттесуін модуляциялай алатынын зерттеу үшін SW620 жасуша лизаттарында анти-ПАКТ антиденелері бар коиммунопреципитация (ко-IP) талдауын жасадық.PKR бақылау жасушаларында анти-ПАКТ-пен жоғары байытылған, ал PKR қалпына келтіру DARS-AS1 шамадан тыс экспрессиялайтын жасушалардан лизаттарда айтарлықтай төмендеді (4б-сурет).Тазартылған таңбаланған PACT және PKR in vitro ақуызды байланыстыру талдаулары үшін пайдаланылды.Тиісінше, DARS-AS1 қамтамасыз еткен, бірақ бақылаушы РНҚ жоқ PACT-PKR әрекеттесуінің басылғанын көрсетті (4c-сурет).Барлық нәтижелер DARS-AS1 PACT және PKR байланысын бұзғанын көрсетті.
a Конфокальды флуоресцентті микроскопияның көмегімен бақылау жасушаларында немесе DARS-AS1 шамадан тыс экспрессиялайтын жасушаларда PACT және PKR бірге локализациясы байқалды.Ядролар DAPI-мен боялған.Статистикалық нәтижелер 16 фотосуреттен алынды.b Бақылау SW620 жасушаларының жасуша лизаттарында немесе DARS-AS1 шамадан тыс экспрессиялайтын жасушаларда анти-ПАКТ антиденелерін қолданатын ко-иммунопреципитация (ко-IP).c Белгіленген PACT, тазартылған PKR және DARS-AS1 немесе жалған РНҚ бар in vitro транскрипциясы in vitro ақуызды байланыстыру талдауы үшін инкубацияланды.Иммунопреципитация үшін туға қарсы антиденелер қолданылды.d Көрсетілген антиденелер бар иммуноблоттар бақылау shRNA немесе DARS-AS1-shRNA трансфекцияланған SW620 және HCT116 жасушаларында орындалды, содан кейін сарысу аштық.e DARS-AS1 экспрессия деңгейлері тапсигаргинге жасушалық сезімталдықты өзгертті.SW620 жасушалары DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 шамадан тыс экспрессия плазмидасымен немесе бақылау плазмидасымен трансфекцияланды.Жасушалар 48 сағат бойы тапсигаргинмен өңделді және жасуша өміршеңдігі MTS реагентінің көмегімен анықталды.f In vitro транскрипцияланған DARS-AS1 немесе жалған РНҚ және тазартылған PACT in vitro белсендіру талдауы және иммуноблотты анықтау үшін пайдаланылды.g Осы антиденелерді пайдаланатын иммуноблоттар SW620-ctrl жасушаларында (сол жақта) немесе PKR мутанттарын шамадан тыс экспрессиялайтын жасушаларда (оң жақта) орындалды.Содан кейін бұл жасушалар бақылау shRNA немесе DARS-AS1-shRNA арқылы трансфекцияланды, содан кейін қан сарысуы ашылды.h Ағындық цитометрия мутантты PKR инактивациясы SW620 жасушаларында DARS-AS1-индукцияланған апоптозды өтейтінін көрсетті.i Көрсетілген антиденелері бар иммуноблоттар SW620 (сол жақта) немесе HCT116 (оң жақта) жасушаларында орындалды.Бақылау shRNA немесе DARS-AS1 shRNA арқылы трансфекцияланған жасушалар сарысудан айырылған және 100 нМ PKR C16 тежегішімен немесе DMSO-мен толықтырылған.Масштаб жолағы = 5 мкм.Көрсетілген деректер үш тәжірибенің орташа ± стандартты ауытқуы болып табылады.* p ≤ 0,05 екі жақты Студенттің t-сынағы.
Әдетте PACT PKR17-мен әрекеттескенде, Thr451-де PKR фосфорлануы индукциялануы мүмкін деп есептеледі.Біздің нәтижелеріміз сарысулық аштықтан кейін DARS-AS1 нокдаун жасушаларында PKR фосфорлану деңгейі айтарлықтай жоғарылағанын көрсетті (4d-сурет және қосымша сурет 4a).Тиісінше, біз негізгі PKR субстраты болып табылатын eIF2α фосфорлануы DARS-AS1 shRNA арқылы айтарлықтай артқанын анықтадық (4d-сурет және қосымша 4a-сурет).Тапсигаргин - бұл ER-нің Са2+ шығаруын тудыратын ER стрессоры.Тапсигаргинмен емдеу PACT экспрессиясын және белсендіруін тудырады, ол PKR-мен одан әрі әрекеттеседі және белсендіреді, бұл eIF2α фосфорлануын арттыру арқылы апоптозға әкеледі 18,61.Мұнда біз DARS-AS1 жасушаларға PACT/PKR жолын тежеу ​​арқылы стрессті жеңуге көмектесе алатынын зерттеу үшін PACT/PKR жолының стимуляторы ретінде тапсигаргинді қолдандық.Біз DARS-AS1 экспрессиясының деңгейі тапсигаргинге жасуша төзімділігімен оң корреляцияланғанын байқадық.DARS-AS1 шамадан тыс экспрессиялайтын SW620 жасушалары тапсигаргинмен өңделген кезде жақсырақ өмір сүрді, ал DARS-AS1 нокдауы бар жасушалар сезімталырақ болды (4e-сурет).Осы нәтижелерге сәйкес, DARS-AS1 шамадан тыс экспрессиясы тапсигаргин-индукцияланған PKR фосфорлануын төмендетті (қосымша сурет 4b).Керісінше, тапсигаргинмен емдеуден кейін PKR және eIF2α бақылау жасушаларымен салыстырғанда DARS-AS1 нокдаун жасушаларында жоғары дәрежеде фосфорланды (Қосымша сурет 4b).Бір қызығы, тапсигаргин DARS-AS1 экспрессиясын дозаға тәуелді түрде индукциялады, бұл DARS-AS1 стресске қарсы функциясын көрсетуі мүмкін (Қосымша 4c сурет).Бұған қоса, біз осы бақылауларды растау үшін in vitro белсендіру талдауларын жасадық.Қысқаша айтқанда, PKR анти-ПКР антиденесінің көмегімен жасуша лизаттарынан тазартылды, содан кейін рекомбинантты PACT және in vitro транскрипцияланған DARS-AS1 инкубацияланды.Ферментативті реакциядан кейін WB көмегімен фосфо-ПКР анықталды.Біздің нәтижелеріміз PKR фосфорлануы DARS-AS1 арқылы айтарлықтай тежелгенін көрсетті, бірақ РНҚ бақылауымен емес (4f-сурет).Бұл in vitro және in vivo нәтижелер DARS-AS1 PACT арқылы PKR белсендіруін тежейтінін көрсетеді.Сонымен қатар, біз DARS-AS1 болған кезде PACT қалпына келтірудің төмендеуін де байқадық (4f-сурет).Бұл нәтиже in vitro ақуызды байланыстыру талдауының нәтижелеріне сәйкес келеді (4c-сурет) және PACT-PKR қауымдастығы үшін DARS-AS1 блоктау функциясын тағы да суреттейді.
PACT D3 доменіндегі Ser246 және Ser287 ұялы стресс жағдайында PKR белсендіруі үшін қажет.Аланинге екі серин қалдықтарын ауыстыру стресс болмаған кезде PKR белсендіретін мутантты PACT (mutD) берді, ал аланинді алмастыру (mutA) хаттаманы өзгертті.Біз бұл доменнің DARS-AS1-мен тікелей байланыста маңыздылығын көрсеткендіктен, біз бұл қалдықтардың DARS-AS1-мен әрекеттесуіне қатыса алатынын тексеру үшін осы екі PACT мутанттарын жасадық.Бір қызығы, екі мутант DARS-AS1-мен байланысу мүмкіндігін жоғалтты (Қосымша 4d-сурет), бұл DARS-AS1-мен тиімді әрекеттесу үшін PACT ақуызының толық құрылымы қажет болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Сонымен қатар, біздің нәтижелеріміз сонымен қатар DARS-AS1-shRNA-индукцияланған жасуша пролиферациясының тежелуін басым теріс PACT мутантын (PACTmutA) немесе басым теріс PKR мутантының (PKRmut) шамадан тыс экспрессиялау арқылы ішінара қалпына келтіруге болатынын көрсетеді (Қосымша сурет 4e. e).Доминант-теріс PKR мутанттарының шамадан тыс экспрессиясы DARS-AS1 нокдаунымен индукцияланған PKR фосфорлануын, сондай-ақ сарысусыз жасушаларда eIF2α фосфорлануын төмендетті (4g-сурет).Ең бастысы, DARS-AS1 нокдаунымен индукцияланған апоптотикалық жасушалардың үлесі PKRmut-ті шамадан тыс экспрессиялайтын жасушаларда да төмендеді (4h-сурет және қосымша 4g-сурет).PKR киназа белсенділігінің тежелуі DARS-AS1 функциясын да бұзады, өйткені нәтижелер көрсеткендей, жасушалар PKR-спецификалық C16 тежегішімен өңделген кезде DARS-AS1 нокдауы PKR және eIF2α фосфорлануын сирек іске қосады (4i-сурет және қосымша 4h-сурет).).Бірге алғанда, біздің нәтижелеріміз DARS-AS1 PACT арқылы PKR белсендіруін тежеу ​​арқылы кем дегенде ішінара жасуша пролиферациясына ықпал етеді деп болжайды.
Ісік пайда болудағы DARS-AS1 рөлін одан әрі зерттеу үшін біз тінтуірдің ксеногрансплантат үлгісін пайдаланып in vivo эксперименттер жасадық. Нәтижелер DARS-AS1 тітіркенуі тышқандардағы ісік өсуін күрт төмендеткенін көрсетеді (p мәні <0,0001) (5а-сурет). Нәтижелер DARS-AS1 тітіркенуі тышқандардағы ісік өсуін күрт төмендеткенін көрсетеді (p мәні <0,0001) (5а-сурет). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Нәтижелер DARS-AS1 нокдаунының тышқандардағы ісік өсуін күрт төмендететінін көрсетеді (p мәні <0,0001) (5а-сурет).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). Нәтижелер DARS-AS1 нокдаунының тышқандардағы ісік өсуін айтарлықтай төмендеткенін көрсетті (p мәні <0,0001) (5а-сурет).Осылайша, DARS-AS1 нокдаун тобында ісіктің орташа көлемінің шамамен 72,9%-ға және ісіктің орташа массасының шамамен 87,8%-ға айтарлықтай төмендеуі байқалды (5b-d-сурет).Бұл нәтижелер DARS-AS1 ісіктің in vivo өсуіне айтарлықтай ықпал ете алатынын көрсетеді.
DARS-AS1 жарнамасының жалаңаш тышқандардағы колоректальды онкогенезге әсері.Өсу қисығы (a), ісік өлшемі (b), салмағы (c) және ісік кескіндері (d) көрсетілген.Қате жолақтары ±SEM көрсетеді. n = 10. ****p < 0,0001, екі жақты Студенттің t сынағы бойынша. n = 10. ****p < 0,0001, екі жақты Студенттің t сынағы бойынша. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 екі жақты Студенттің t-тесті.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 екі жақты Студенттің t-тесті.e Каплан-Майер DARS-AS1 экспрессия деңгейлері мен UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM және LGG бар науқастардағы жалпы өмір сүру арасындағы корреляцияны талдады.Пациенттердегі DARS-AS1 экспрессиясының жоғары деңгейі жоғарғы 50% болды;пациенттердегі DARS-AS1 экспрессиясының төмен деңгейі төменгі 50% болды.p-мәндері лог rank сынағы арқылы анықталды.f DARS-AS1 PACT-PKR жолын және ісік өсуін реттейтін ұсынылған модель.
DARS-AS1 клиникалық әсерін жақсырақ түсіну үшін біз оның экспрессиясы мен пациенттің өмір сүруі арасындағы корреляцияны зерттедік.TCGA деректер жинағын талдау арқылы біз жоғары DARS-AS1 экспрессиясы увеальды меланома (UVM), бүйрек хромофобия (KICH), бүйрек папиллярлы жасушалық карцинома (KIRP), мезотелиома (MESO), мультиплекспен байланысты екенін анықтадық.Төменгі өмір сүру деңгейі глиобластома морфозымен (GBM) және төмен дәрежелі ми глиомасы (LGG) бар науқастармен айтарлықтай байланысты болды (5e-сурет).Бұл нәтижелер DARS-AS1 ісіктердің клиникалық прогрессиясында маңызды рөл атқара алатынын және көптеген қатерлі ісіктерде ықтимал болжамды биомаркер болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Бұл зерттеуде кең ауқымды CRISPRi функционалдық скринингті пайдалана отырып, біз DARS-AS1 lncRNA екі негізгі стресс-жауап берушілерді, PACT және PKR реттеу арқылы рак клеткаларының стрессін жеңетінін анықтадық.PACT-пен тікелей әрекеттесе отырып, DARS-AS1 PACT-делдалдық PKR белсендіруін тежеп, осылайша апоптотикалық жасушалардың өлімін болдырмайды және жасуша пролиферациясын ынталандырады (5f-сурет).DARS-AS1 жоғарылауы қатерлі ісіктің көптеген түрлерінде байқалды, бұл оның стресстік жағдайларда қатерлі ісік жасушаларының өмір сүруіне ықпал ету функциясы қатерлі ісіктің көптеген түрлеріне кеңінен қолданылуы мүмкін екенін көрсетеді.
PACT PKR активатор ақуызы ретінде анықталды және PACT арқылы PKR белсендіру транскрипцияны, трансляцияны, апоптозды және басқа маңызды жасушалық процестерді реттеу арқылы стресстік жауаптарда маңызды рөл атқарады62.Ондаған жылдар бойы PACT-PKR каскадының қатерлі ісікке тән реттеуін түсіну әрекеттері жасалды.Мұнда біздің зерттеуіміз PACT-пен тікелей байланысатын, PACT-PKR өзара әрекеттесуін блоктайтын, PKR активациясын және eIF2α фосфорлануын тежейтін, осылайша стресстен туындаған апоптозды және қатерлі ісік пролиферациясын ынталандырады.жасушалар.Бұл ашылу қатерлі ісік болжамы мен терапиясы үшін ықтимал lncRNA мақсаттарына жарық түсіреді.
Біздің деректеріміз DARS-AS1 нокдаунының фосфорланған PKR және eIF2α айтарлықтай жоғарылауымен жасушаларды сарысу аштығына сезімтал ететінін көрсетті.Бұл нәтижелер DARS-AS1 PACT/PKR белсенділігін тежеу ​​арқылы ауыр жағдайларда рак клеткаларының өмір сүруіне ықпал ететінін көрсетеді.ASPACT және nc886 сияқты бірнеше басқа кодталмаған РНҚ PACT48 mRNA-ны төмендету немесе PKR49,50,64-пен байланысу арқылы автофосфорлануды реттеу арқылы PACT/PKR осіне қатысады.Олардың ішінде DARS-AS1 PACT-PKR қауымдастығын бұзушы ретінде әрекет етеді.Бұл зерттеу PACT/PKR осін реттеу және стресс жауаптарындағы lncRNA рөлі туралы түсінігімізді байытады.
PACT құрамында үш бөлек домен бар.Алғашқы екі dsRBD-нің әрқайсысы PACT-тың PKR-ге жоғары жақындықпен байланысуына жету үшін жеткілікті, ал үшінші домен (D3) PKR-ді in vitro және in vivo белсендіру үшін қажет.Біздің зерттеуіміз DARS-AS1 артықшылықты түрде D3 доменімен әрекеттесетінін көрсетті (3h-сурет).lncRNA (768 нуклеотид) үлкен өлшемін ескере отырып, DARS-AS1 D3 байланысуы dsRBD және PKR PACT домені арасындағы өзара әрекеттесуді физикалық түрде тежей алады, осылайша PACT және PKR ассоциациясын блоктайды.D3-тегі Ser246 және Ser287-ні аланинмен немесе аспартатпен алмастырған PACT нүктесі мутациялары оның DARS-AS1-ге байланысуын бұзды, бұл олардың бірлесуіндегі D3-тің жалпы құрылымдық және электрлік қасиеттерінің маңыздылығын көрсетеді.Болашақта дәлірек биохимиялық талдауды және жоғары ажыратымдылықтағы PACT құрылымдық талдауын қолдана отырып, бұл механизм туралы қосымша мәліметтер қажет болады.
Алдыңғы зерттеулер DARS-AS1 бірнеше механизмдер арқылы жасуша пролиферациясына ықпал ететінін хабарлады51,52,53.Бір мысалда, зерттеушілер DARS-AS1 бүйрек қатерлі ісігінің жасушаларында miP-194-5p нысанаға алу арқылы антисенсті ақуызды кодтайтын DARS генін жоғарылататынын байқады.Дегенмен, осы зерттеуде DARS-AS1 нокдауы қатерлі ісіктің көптеген түрлерінде, соның ішінде кем дегенде колоректальды, сүт безі және бауыр қатерлі ісігінде DARS транскрипциясына аз әсер етті.lncRNA-лар жасуша мен ұлпаға тән экспрессия үлгілерін көрсететіндіктен, функционалдық механизмдер қатерлі ісік түрлерінде сақталмауы мүмкін, бұл біздің бақылауларымыз бен әртүрлі қатерлі ісіктердің алдыңғы бағалаулары арасындағы сәйкессіздікке ықпал етуі мүмкін.Әртүрлі физиологиялық және патологиялық процестердің нақты механизмдерін түсіндіру үшін арнайы зерттеулер қажет.
Клиникалық деректерді талдау ісіктердегі DARS-AS1 экспрессиясы онкологиялық науқастардың өмір сүруімен кері байланыста екенін көрсетті, бұл DARS-AS1/PACT/PKR осінің қатерлі ісік болжамындағы маңыздылығын көрсетеді.Қорытындылай келе, біздің зерттеуіміз DARS-AS1 PACT/PKR сигналдық осінің реттеушісі болып табылатынын, рак клеткаларының көбеюіне ықпал ететінін және стресске жауап беру кезінде апоптозды тежейтінін көрсетеді, бұл зерттеудің басқа желісін қамтамасыз етеді және болашақ емдеу әдістерін зерттеу үшін қызығушылық тудырады. .
SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 және HEK293T адамның жасушалық желілері Қытайдағы Ұлттық ұялы желі ресурстарының инфрақұрылымынан алынды.Барлық жасушалар 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) және 1% пенициллин-стрептомицин (Thermo Fisher Scientific) қосылған DMEM ортасында (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 37°C, 5% CO2 жағдайында ұсталды.инкубатор.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Анти-ПКР (фосфо-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764) ;анти-eIF2α (фосфор S51), Abcam (ab32157);анти-PACT (фосфор S246), Abgent (AP7744b);анти-β-тубулин, CST (2128);қалыпты тышқан IgG, CST (5415S);қалыпты қоян IgG, CST (2729S).Антиденелер Western blotting үшін PBST ішінде 1:1000 және IP үшін 1:100 сұйылтылған.
sgRNAs CRISPR-ERA66 деп аталатын жалпыға қолжетімді құрал арқылы әзірленді.Біз sgRNA әзірлеу үшін әдепкі құрал параметрлерін және 3 кб аймағындағы есептелген sgRNA байланыстыру учаскелерін алгоритмді қолдандық.TSS орталығында орналасқан.sgRNA олигонуклеотидтерінің пулдары CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) компаниясында синтезделді және гуманизацияланған pgRNA плазмидаларына клондалды (Addgene #44248).Барлығы 12 мкг біріктірілген гуманизацияланған pgRNA плазмидасы, 7,2 мкг psPAX2 (Addgene #12260) және 4,8 мкг pMD2.G (Addgene #12259) 106 мкг Трансфекция DNA дисфектісі арқылы 5 x 106 HEK293T трансфекциясына қосылды. ұяшықтар (CWBIO, Пекин, Қытай) өндірушінің нұсқауларына сәйкес.Құрамында вирусы бар супернатанттар трансфекциядан кейін 48 және 72 сағаттан кейін жиналып, 0,45 мкм сүзгі арқылы сүзілді.Скрининг үшін dCas9/KRAB синтез ақуызын білдіретін SW620 жасушалары вирус трансдукциясы арқылы алынды.Өзгертілген SW620 жасушалары MOI 0,1-0,3 төрт тәуелсіз инфекция экспериментінде вирус кітапханасымен жұқтырылды және 2 күн бойы 2 мкг/мл пуромицинмен (Сигма, Сент-Луис, МО) сынама алынды.Одан кейін жасушалар скрининг үшін 500 жасуша/сгРНҚ ең аз кітапхана қамтуымен in vitro 18 күн бойы өсірілді.
Геномдық ДНҚ QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Дюссельдорф, Германия; 51183) нұсқауларына сәйкес экстракцияланды.Кітапхананы құру үшін барлығы бір биологиялық қайталауға 100 мкг геномдық ДНҚ жұмсалды.sgRNA аймағы ПТР екі раундымен күшейтіліп, штрих-кодпен байланыстырылды.
ПТР өнімдері NucleoSpin® гелі және ПТР тазарту жинағы (MACHEREY-NAGEL, Дюрен, Германия; 740609.250) арқылы тазартылды және Qubit™ HS қос тізбекті ДНҚ анықтау жинағы (Thermo Fisher Scientific; Q32854) арқылы сандық мәндері анықталды.
MTS талдауы жасуша пролиферациясын өлшеу үшін пайдаланылды.Жасушалар 2000 ұяшық/ұңғыма бастапқы тығыздықта 96 шұңқырлы тақталарға себілді.Жасушалардың салыстырмалы саны күн сайын көрсетілген уақытта барлығы 4-6 күн бойы өлшенді.Әрбір ұңғыма үшін 20 мкл МТС реактиві (Promega) 100 мкл DMEM сұйылтылған, 37°C температурада 4 сағат бойы жасушалармен инкубацияланған, содан кейін OD490 өлшенген.
Сфералардың қалыптасуын талдау арқылы анкорсыз өсу мүмкіндігі анықталды.Қысқаша айтқанда, shRNA DARS-AS1 немесе бақылау shRNA арқылы трансфекцияланған 2000 жасуша әр 4 күн сайын орташа өзгеретін ультра төмен бекітілген микропластинкаларда (Корнинг) өсірілді.Сфероидтар 14 күннен кейін саналды.Күшейтуді талдау үшін DARS-AS1 шамадан тыс экспрессиялық плазмидпен немесе бақылау плазмидасымен трансфекцияланған 500 жасуша пайдаланылды, әйтпесе әдіс өзгеріссіз қалды.
РНҚ T7 РНҚ полимераза және биотин-16-UTP (Roche 1138908910) көмегімен Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) нұсқауларына сәйкес транскрипцияланды.Мұнда қолданылатын праймерлер қосымша 4 кестеде келтірілген.
Протеинді кодтайтын PACT немесе PKR аймақтары pET15b (Addgene #73619) клондалды және BL21(DE3) түрлендірілді.Бактериялар ампициллинмен қамтамасыз етілген LB-де түні бойы инкубацияланды, содан кейін жаңа LB-мен 100 есе сұйылтылды.Ортаның OD600 мәні 0,8-ге жеткенде, ақуыз экспрессиясын индукциялау үшін 1 мМ IPTG қосылды.Түнде жұмсақ шайқаумен (20°C температурада 250 айн/мин) инкубациялаудан кейін жасуша түйіршіктері центрифугалау (4000 айн/мин, 10 мин, 4°C) арқылы жиналды.Жасуша түйіршіктерін лизис буферінде (50 мМ Tris, рН 8,0, 250 мМ NaCl, 1 мМ PMSF) қайта суспензия және мұзда 30 минут инкубациялаңыз, содан кейін ультрадыбыспен (15 мин, 5 с қосу/өшіру, мұзда) және центрифугалау (13,00) айн/мин)., 30 мин, 4°С).Содан кейін үстіңгі қабат Ni-NTA шайырына (QIAGEN) 4°C температурада 3 рет жүктелді, 4 рет жуу буферімен (50 мМ Tris, рН 8,0, 40 мМ имидазол, 250 мМ NaCl) жуылды және жалпы мөлшерімен 3 рет элюталанды. 10 мл элюент буферінің (50 мМ Tris, рН 8,0, 250 мМ NaCl, 300 мМ имидазол).Тазартылған ақуыз WB көмегімен анықталды және концентрация Qubit™ ақуыз талдау жинағы (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) арқылы анықталды.
RIP талдаулары модификацияларымен бұрын сипатталғандай орындалды.Қысқаша айтқанда, 1x RIP буфері (25 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 0,5% NP-40, RNasin рибонуклеаза ингибиторы (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 мМ DDM, протеаза) xtostatic 101cyc7 1 мМ лизистері (Roche, 1 мМ DTT) және 4 °C температурада 15 минут бойы 13 000 айн/мин центрифугалау.Содан кейін үстіңгі қабат 5 мкг анти-ПАКТ антиденелерімен (Abeam) немесе IgG (CST) конъюгацияланған A+G магниттік моншақтарымен (Миллипор) инкубацияланды.Моншақтар 5 рет 5x RIP буферімен жуылды, содан кейін протеиназа K (NEB) арқылы қорытылды.РНҚ Тризолмен экстракцияланды және RT-qPCR арқылы анықталды.Праймерлер қосымша 5-кестеде берілген.
In vitro RIP талдауы модификацияланған стандартты RIP талдау протоколына сәйкес орындалды.Барлығы 5 пмоль in vitro транскрипцияланған РНҚ RIP буферімен 1 рет сұйылтылған және 65°C температурада 5 минут бойы инкубациялау арқылы жасытылған, содан кейін бөлме температурасына дейін баяу салқындату.Тұтас немесе мутацияланған жалауша таңбаланған PACT ақуыздарының жалпы саны 5 pmol E. coli-ден тазартылды.Ренатурацияланған РНҚ-мен 4°C температурада 2 сағат бойы инкубациялаңыз және туға қарсы IP үшін RIP талдауы үшін жоғарыда көрсетілген процедураны орындаңыз.
РНҚ кеңейтімін талдау үшін 1x107 жасуша 1xRIP буферімен лизиденді.4°C температурада 15 минут бойы 13 000 айн/мин центрифугалаудан кейін үстіңгі қабат 4°C температурада 2 сағат бойы 30 мкл стрептавидин магниттік моншақтарымен (Бекман) алдын ала өңделді.Содан кейін тазартылған лизат ашытқы тРНҚ-мен қамтамасыз етілді және түні бойы 4°C температурада 40 пмоль ренатурацияланған РНҚ-мен инкубацияланды, содан кейін тағы 2 сағат және BSA-мен блокталған 20 мкл жаңа стрептавидин магниттік моншақтары қосылды.Жуу қадамы 5x RIP буферімен 4 реттен және 1x RIP буферімен 4 реттен тұрды.Сәйкес ақуыздар биотинді элюционды буфермен (25 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 12,5 мМ D-биотин, PMSF) элюцияланды және NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) арқылы бөлінді.Күміспен бояудан кейін (Beyotime Biotechnology) белгілі бір жолақтар эксцизделген және MS арқылы талданған.
PACT және PKR арасындағы өзара әрекеттесуді тексеру үшін Co-IP талдауы жасалды.Қысқаша айтқанда, супернатантты лизаттар 1 x RIP буферінде 1 x 107 лизиске ұшыраған жасушаны инкубациялау, содан кейін 4°C температурада 15 минут бойы 13000 айн/мин центрифугалау арқылы дайындалды.Лизаттарға 5 мкг анти-ПАКТ антиденелерімен конъюгацияланған A + G протеинінің магниттік түйіршіктері жүктелді және түні бойы 4°C температурада ақырын айналдырылды.Моншақтар 3 рет 5×RIP буферімен, екі рет 1×RIP буферімен жуылды және 1×SDS буферімен элюцияланды.Қалпына келтірілген протеин SDS-PAGE гелімен талданды және WB анықтады.
Екі пмоль жалаушаланған PACT және 1 пмоль PKR E. coli-ден тазартылды.1× RIP буферінде сұйылтыңыз және 4 °C температурада 2 сағат бойы 10 пмоль ренатурацияланған РНҚ-мен инкубациялаңыз.Осыдан кейін олар A+G протеинінің магниттік моншақпен конъюгацияланған антитаңбаланған антиденелерімен қосымша екі сағат бойы инкубацияланды.Содан кейін моншақтар 1x RIP буферімен төрт рет жуылды және 1x SDS буферімен элюталанды.Алынған PACT және PKR ДДБ анықтады.