Жаңалықтар

Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз пайдаланып жатқан шолғыш нұсқасында шектеулі CSS қолдауы бар.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Әзірше, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Белсендірілген эфирлерге немесе фенокси радикалдарына негізделген ферментативті жақындықты таңбалау әдістері тірі жасушалардағы субклеткалық протеомдар мен ақуыздық интеракторларды картаға түсіру үшін кеңінен қолданылады.Дегенмен, белсендірілген эфирлер аз реактивті, нәтижесінде таңбалау радиусы кең болады және пероксидпен өңдеу нәтижесінде пайда болған фенокси радикалдары тотығу-тотықсыздану жолдарына кедергі келтіруі мүмкін.Мұнда біз miniSOG фотосенсибилизатор протеинін қызығушылық танытатын ақуызға генетикалық байланыстыру арқылы жасалған жақындық таңбалауға тәуелді фотоактивация (PDPL) әдісі туралы хабарлаймыз.Көк жарықпен іске қосылады және экспозиция уақытымен басқарылады, синглет оттегі түзіледі, содан кейін анилин зонды арқылы гистидин қалдықтарының кеңістік-уақытша шешілген таңбалануына қол жеткізіледі.Біз оның жоғары дәлдігін органеллаға тән протеомды карталау арқылы көрсетеміз.PDPL-ді TurboID-пен қатар салыстыру PDPL-тің неғұрлым нақты және жан-жақты протеомдық қамтуын көрсетеді.Содан кейін біз аурумен байланысты транскрипциялық коактиватор BRD4 және E3 Паркин лигазасына PDPL қолдандық және бұрын белгісіз интеракторларды таптық.Шамадан тыс экспрессиялық скрининг арқылы Паркин үшін екі белгісіз субстрат, Ssu72 және SNW1 анықталды, олардың деградациясы убиквитинация-протеазома жолы арқылы жүзеге асырылады.
Ақуыз желілерінің дәл сипаттамасы көптеген іргелі жасушалық процестердің негізінде жатыр.Сондықтан белоктардың өзара әрекеттесуінің жоғары дәлдіктегі кеңістік-уақыттық картасы биологиялық жолдарды, ауру патологиясын ашуға және емдік мақсатта осы өзара әрекеттесулерді бұзуға молекулалық негіз береді.Осы мақсатта тірі жасушалардың немесе тіндердің уақытша өзара әрекеттесуін анықтауға қабілетті әдістер өте қажет.Афинитті тазарту масс-спектрометриясы (AP-MS) қызығушылық тудыратын ақуыздардың (POI) байланыстырушы серіктестерін анықтау үшін тарихи түрде қолданылған.Сандық протеомика әдістерінің дамуымен Bioplex3.0 құрылды, AP-MS негізіндегі ақуыз желілерінің ең үлкен деректер базасы.AP-MS өте қуатты болғанымен, жұмыс процесіндегі жасуша лизисі және сұйылту қадамдары әлсіз және өтпелі байланыстыру әрекеттесулеріне бағытталған және лизиске дейін бөлімшеленуі жоқ жалған өзара әрекеттесу жұптары сияқты лизистен кейінгі артефакттарды енгізеді.
Осы мәселелерді шешу үшін өзара байланысты топтары бар табиғи емес аминқышқылдары (UAA) және жақын маңдағы ферментативті таңбалау (PL) платформалары (мысалы, APEX және BioID)5 әзірленді.UAA әдісі көптеген сценарийлерде сәтті қолданылғанымен және тікелей ақуыз желімдері туралы ақпаратпен қамтамасыз етілсе де, UAA енгізу орнын оңтайландыру әлі де қажет.Ең бастысы, бұл таңбалау оқиғаларының каталитикалық кері айналуы жоқ стехиометриялық таңбалау әдісі.Керісінше, BioID әдісі сияқты ферментативті PL әдістері инженерлік биотин лигазасын POI7-ге біріктіреді, ол кейіннен биотинді белсенді биотинил-АМФ эфирінің аралық өнімін қалыптастыру үшін белсендіреді.Осылайша, фермент проксимальды лизин қалдықтарын белгілейтін белсендірілген биотин «бұлтын» катализдейді және шығарады.Дегенмен, BioID жеткілікті таңбаланған сигналды алу үшін 12 сағаттан астам уақытты қажет етеді, бұл оны уақытша ажыратымдылықпен пайдалануды болдырмайды.Ашытқы дисплейіне негізделген бағытталған эволюцияны пайдалана отырып, TurboID 10 минут ішінде биотинмен тиімді таңбалауға мүмкіндік беріп, анағұрлым динамикалық процестерді зерттеуге мүмкіндік беретін тиімдірек болу үшін BioID негізінде жасалған.TurboID жоғары белсенді болғандықтан және эндогендік биотин деңгейлері төмен деңгейлі таңбалау үшін жеткілікті болғандықтан, экзогендік биотинді қосу арқылы жоғары жақсартылған және уақытты белгілеу қажет болғанда фондық таңбалау ықтимал проблемаға айналады.Сонымен қатар, белсендірілген эфирлер нашар реактивті (t1/2 ~5 мин), бұл үлкен таңбалау радиусына әкелуі мүмкін, әсіресе көрші ақуыздардың биотинмен қанығуынан кейін 5. Басқа тәсілде инженерлік аскорбат пероксидазасының генетикалық синтезі (яғни биотин- фенол радикалдары және бір минут ішінде ақуызды таңбалауға мүмкіндік береді9,10.APEX субклеткалық протеомдарды, мембраналық ақуыз кешендерін және цитозолдық сигналдық ақуыз кешендерін анықтау үшін кеңінен қолданылады11,12. Дегенмен, пероксидтердің жоғары концентрацияларына деген қажеттілік тотығу-тотықсыздану ақуыздарына немесе жолдарға әсер етуі мүмкін. жасушалық процестер.
Осылайша, жасушалық жолдарды айтарлықтай бұзбай, жоғары кеңістіктік және уақыттық дәлдікпен реактивті таңбаланған радиусты басу түрлерін жасауға қабілетті жаңа әдіс қолданыстағы әдістерге маңызды қосымша болады. Реактивті түрлердің ішінде синглетті оттегі өзінің қысқа өмір сүруіне және шектеулі диффузиялық радиусына байланысты (жасушаларда t1/2 < 0,6 мкс)13 біздің назарымызды оятты. Реактивті түрлердің ішінде синглетті оттегі өзінің қысқа өмір сүруіне және шектеулі диффузиялық радиусына байланысты (жасушаларда t1/2 < 0,6 мкс)13 біздің назарымызды оятты. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни және ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Белсенді формалардың ішінде синглетті оттегі өзінің қысқа өмір сүру ұзақтығы және шектеулі диффузиялық радиусы (жасушаларда t1/2 < 0,6 мкс) 13 себебінен біздің назарымызды аударды.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs 中t1/2 < 0,6 µs 1/2 < 0,6 μs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекат синглетный кислород из-за его короткого времени жизни және ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Белсенді формалардың ішінде синглетті оттегі біздің назарымызды өзінің қысқа өмір сүру ұзақтығымен және шектеулі диффузиялық радиусымен (жасушаларда t1/2 < 0,6 мкс) тартады.Синглетті оттегі метионинді, тирозинді, гистидинді және триптофанды кездейсоқ тотықтыратыны хабарланған, бұл оны аминге немесе тиолға негізделген зондтарға бекіту үшін полярлы 14,15 құрайды16,17.Синглеттік оттегі субклеткалық бөлімнің РНҚ-сын таңбалау үшін пайдаланылғанымен, эндогендік POI жақындық маркерлерін қайта пайдалану стратегиялары әлі зерттелмеген.Мұнда біз фотоактивацияға тәуелді жақындық таңбалауы (PDPL) деп аталатын платформаны ұсынамыз, онда біз miniSOG фотосенсибилизаторымен біріктірілген POI-ларды жарықтандыру және проксимальды қалдықтарды тотықтыру үшін синглеттік оттегінің генерациясын іске қосу үшін көк жарықты қолданамыз, содан кейін химиялық зондтарды тотықтыру үшін құрамында амині бар модификациялар. аралық тірі жасушалар..Біз ашық протеомика жұмыс үрдісін пайдалана отырып, тегтердің ерекшелігін арттыру және модификациялау орындарын анықтау үшін химиялық зондтар тобын сынадық.PDPL-ді TurboID-пен қатар салыстыру PDPL-тің неғұрлым нақты және жан-жақты протеомдық қамтуын көрсетеді.Біз бұл әдісті субклеткалық протеоманың органелла-спецификалық маркерлеріне және обырмен байланысты эпигенетикалық реттеуші ақуыз BRD4 және Паркинсон ауруымен байланысты E3 лигаза Паркин үшін байланыстыратын серіктестердің жалпы протеомды идентификациясына қолдандық, бұл ақуыздың белгілі және белгісіз желісін растады. өзара әрекеттесулер..PDPL-тің үлкен ақуыз кешендеріндегі E3 субстраттарын тану қабілеті жанама байланыстырғыштарды тану қажет болатын жағдайды білдіреді.Убиквитинация-протеазома арқылы жүзеге асырылатын екі белгісіз паркин субстраты in situ расталды.
Фотодинамикалық терапия (PDT)19 және хромофор көмегімен лазерлік инактивация (CALI)20, онда фотосенсибилизаторлармен жарық сәулелену синглеттік оттегін тудырады, мақсатты ақуыздарды белсендірмейді немесе жасуша өліміне әкелуі мүмкін.Синглетті оттегі теориялық диффузиялық қашықтығы шамамен 70 нм болатын жоғары реактивті зат болғандықтан, фотосенсибилизатордың айналасындағы кеңістікте шектелген тотығуды бақылауға болады.Осы тұжырымдамаға сүйене отырып, біз тірі жасушалардағы ақуыз кешендерінің жақын таңбалануына қол жеткізу үшін синглет оттегін пайдалануды шештік.Біз төрт функцияны орындау үшін PDPL химопротеомдық тәсілін әзірледік: (1) PL ферментативті тәсіліне ұқсас белсенді синглет оттегінің генерациясын катализдеу;(2) жарық басталған кезде уақыт бойынша шешілетін таңбалауды қамтамасыз ету;(3) өзгерту арқылы (4) Фонды азайту үшін эндогендік кофакторларды (мысалы, биотин) пайдаланудан аулақ болыңыз немесе қоршаған ортаның күйзелісіне жасуша әсерін азайту үшін жоғары алаңдататын экзогенді реагенттерді (мысалы, пероксидтер) пайдаланыңыз.
Фотосенсибилизаторларды екі санатқа бөлуге болады, соның ішінде шағын молекулалық салмақты флюорофорлар (мысалы, раушан бенгал, метилен көк)22 және генетикалық кодталған шағын ақуыздар (мысалы, miniSOG, KillerRed)23.Модульдік дизайнға қол жеткізу үшін біз POI24,25-ке фотосенсибилизатор (PS) ақуыздарын қосу арқылы бірінші буын PDPL платформасын жасадық (1а-сурет).Көк жарықпен сәулелендіргенде синглет оттегі проксимальды нуклеофильді аминқышқылдарының қалдықтарын тотықтырады, нәтижесінде электрофильді және амин зондының нуклеофильдерімен одан әрі әрекеттесуі мүмкін умполунг полярлығы пайда болады16,17.Зонд LC/MS/MS сипаттамасы үшін шерту химиясына және төмен қарай тартуға мүмкіндік беретін алкин тұтқасымен жасалған.
miniSOG көмегімен ақуыз кешендерін таңбалаудың схемалық суреті.Көк жарық әсер еткенде, miniSOG-POI экспрессиясы бар жасушалар өзара әрекеттесетін ақуыздарды өзгертетін, бірақ байланыспайтын белоктарды өзгертетін синглет оттегін жасайды.Фотототықтырудың аралық өнімдері ковалентті қосындылар түзу үшін амин-химиялық зондтың релелік белгілерімен ұсталады.Химия зондындағы алкинил тобы төмен түсіру арқылы байыту үшін химияны басу, содан кейін LC-MS/MS сандық анықтауға мүмкіндік береді.b 1-4 амин зондтарының химиялық құрылымы.c 1-4 зондтары арқылы митохондриялық локализацияланған miniSOG-делдалдық протеомдық маркерлердің репрезентативті флуоресцентті гель талдауы және гель денситометриясына негізделген салыстырмалы сандық анықтау.Химиялық зондтардың сигнал-фон қатынасы көк жарықты қоспағанда теріс бақылау эксперименттері немесе miniSOG экспрессиясы жоқ HEK293T ұяшықтары арқылы бағаланды.n = 2 биологиялық тәуелсіз үлгі.Әрбір нүкте биологиялық көшірмені білдіреді.d Көрсетілген PDPL құрамдастары бар немесе жоқ болған кезде оңтайландырылған 3 зондты пайдаланып PDPL өкілін анықтау және сандық анықтау c.n = 3 биологиялық тәуелсіз үлгі.Әрбір нүкте биологиялық көшірмені білдіреді.Орталық сызықтар мен мұртшалар орташа және ± стандартты ауытқуды білдіреді.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Алыс қызыл Si-DMA дақтары бар синглет оттегінің конфокальды кескіні.Масштаб жолағы: 10 мкм.Гельді бейнелеу және конфокальды эксперименттер ұқсас нәтижелермен кем дегенде екі рет тәуелсіз қайталанды.
Біз алдымен HEK293T-де тұрақты түрде көрсетілген miniSOG26 және KillerRed23 жетілген фотосенсибилизаторлардың химиялық зонд ретінде протеоманың пропаргиламинді таңбалауына делдал болу мүмкіндігін сынадық (Қосымша 1а сурет).Гельдік флуоресценция талдауы miniSOG және көк жарық сәулеленуі арқылы толық протеомды таңбалауға қол жеткізілгенін, ал KillerRed-те көрінетін таңбалау өнімі байқалмағанын көрсетті.Сигнал-фон қатынасын жақсарту үшін біз анилин (1 және 3), пропиламин (2) немесе бензиламин (4) бар химиялық зондтар жинағын сынадық.Біз HEK293T жасушаларының өздерінің көк жарықпен салыстырғанда жоғары фондық сигналға ие екенін байқадық, бұл эндогендік рибофлавин фотосенсибилизаторы, флавин мононуклеотиді (FMN) 27 арқасында болуы мүмкін. Анилин негізіндегі 1 және 3 химиялық зондтар жақсырақ ерекшелік берді, HEK293T митохондриялардағы miniSOG тұрақты экспрессиясымен 3-зонд үшін сигналдың >8 есе артуын көрсетеді, ал 2-зонд РНҚ-таңбалау әдісінде CAP-seq тек ~2,5- көрсетеді. бүктеме сигналының жоғарылауы, мүмкін, РНҚ мен ақуыз арасындағы әртүрлі реактивтілік таңдауларына байланысты (1b, c-сурет). Анилин негізіндегі 1 және 3 химиялық зондтар жақсырақ ерекшелік берді, HEK293T митохондриялардағы miniSOG тұрақты экспрессиясымен 3-зонд үшін сигналдың >8 есе артуын көрсетеді, ал 2-зонд РНҚ-таңбалау әдісінде CAP-seq тек ~2,5- көрсетеді. бүктеме сигналының жоғарылауы, мүмкін, РНҚ мен ақуыз арасындағы әртүрлі реактивтілік таңдауларына байланысты (1b, c-сурет).Анилин негізіндегі 1 және 3 химиялық зондтар жақсырақ ерекшелік көрсетті: митохондриядағы miniSOG-ны тұрақты түрде білдіретін HEK293T 3-зонд үшін сигналдың 8 еседен астам жоғарылауын көрсетеді, ал 2-зонд CAP-seq РНҚ таңбалау әдісінде қолданылады, тек сигналдың ~2,5 есе артуын көрсетеді, бәлкім, РНҚ мен ақуыз арасындағы әртүрлі реактивтіліктің артықшылығына байланысты (сурет 1b, c).Minisog, 探针 3 粒体更更 好更 的具有 更更 更更 更更 更更特异性探针 的更 更更 更更特异性探针探针 特异性在特异性表达表达表达, 探针 3 的的 增加增加> 8 ₸, 8 ₸, 8倍, 而而 用用 于 标记 标记 标记 标记 方法 方法 Cap-Seq 的 探针 2 探针 探针 2 探针的显示2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c＂基于 苯胺 苯胺 的 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 具有 在 在 具有 具有 具有 粒体 粒体 在 粒体 在 粒体 更 具有 在 粒体 在 粒体 粒体 粒体 粒体 粒体 粒体 粒体 粒体 粒体 的 粒体 粒体 粒体 粒体 粒体 粒体 粒体 粒体 粒体 在 在 粒体 更 粒体 的 粒体 粒体 粒体 粒体 粒体 中 稳定 粒体 粒体 粒体 粒体 粒体 中 稳定 增加 增加 增加> 8 倍倍倍 而 于 于 增加 于 标记 标记 标记 标记 标记 标记 标记 仅 e 2 仅 2 仅 ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAАнилин негізіндегі 1 және 3 химиялық зондтар жақсырақ спецификаға ие болды, HEK293T митохондриядағы miniSOG тұрақты экспрессияға ие болды, ал 3 зонд сигналдың 8 еседен астам артуына ие болды, ал CAP-seq РНҚ таңбалау әдісіне арналған 2 зонд тек ~2,5 есе өсуді көрсетті.сигналда, бәлкім, РНҚ мен ақуыз арасындағы әртүрлі реакция преференцияларына байланысты (сурет 1b, c).Сонымен қатар, зонд 3 изомерлері мен гидразинді зондтар (5, 6, 7 зондтары) сыналған, бұл 3 зондтың оңтайландырылғанын растайды (Қосымша 1b,c сурет).Сол сияқты, гель ішіндегі флуоресценция талдауы басқа оңтайландырылған эксперименттік параметрлерді анықтады: сәулелену толқын ұзындығы (460 нм), химиялық зонд концентрациясы (1 мМ) және сәулелену уақыты (20 мин) (Қосымша 2a–c сурет).PDPL хаттамасындағы кез келген құрамдас немесе қадамды өткізіп жіберу сигналдың фонға айтарлықтай өзгеруіне әкелді (1d-сурет).Атап айтқанда, синглетті оттегін сөндіретін натрий азиді немесе тролокс болған кезде ақуыз таңбалауы айтарлықтай төмендеді.Синглетті оттегін тұрақтандыратын белгілі D2O болуы таңбалау сигналын күшейтеді.Басқа реактивті оттегі түрлерінің таңбалауға қосқан үлесін зерттеу үшін гидроксил және супероксид радикалдарын тазарту үшін тиісінше 18, 29 орнату үшін маннитол және С витамині қосылды, бірақ олар таңбалауды азайтатыны табылмады.H2O2 қосу, бірақ жарықтандыру емес, таңбалауға әкелмеді (Қосымша 3a-сурет).Si-DMA зондтары бар флуоресцентті синглеттік оттегі кескіні HEK293T-miniSOG сымында синглет оттегінің болуын растады, бірақ бастапқы HEK293T сымында емес.Бұған қоса, mitoSOX Red жарықтан кейін супероксид өндірісін анықтай алмады (1e-сурет және қосымша 3b-сурет) 30. Бұл деректер синглет оттегінің кейінгі протеомдық таңбалауға жауапты негізгі реактивті оттегі түрі екенін нақты көрсетеді.PDPL цитоуыттылығы көк жарық сәулеленуін және химиялық зондтарды қоса бағаланды және айтарлықтай цитотоксиктік байқалмады (қосымша 4a сурет).
Таңбалау механизмін зерттеу және LC-MS/MS көмегімен ақуыз кешендерін протеомдық идентификациялауға мүмкіндік беру үшін алдымен қандай аминқышқылдары өзгертілгенін және зонд белгілерінің дельта массасын анықтау керек.Метионин, гистидин, триптофан және тирозин синглетті оттегімен өзгертілгені туралы хабарланды14,15.Біз TOP-ABPP31 жұмыс процесін MSFragger32 негізіндегі FragPipe есептеу платформасы ұсынатын бейтарап ашық іздеумен біріктіреміз.Синглетті оттегі модификациясы мен химиялық зондты таңбалаудан кейін клик химиясы құрамында бөлінетін байланыстырушы бар биотинді азайту жапсырмасы арқылы орындалды, содан кейін нейтравидинді созу және трипсинді қорыту.Модификацияланған пептид, әлі де шайырмен байланысқан, LC-MS/MS талдауы үшін фотобөлінді (2а-сурет және қосымша деректер 1).Тізімде 50-ден астам пептидтік карта (PSM) сәйкестігі бар протеомда көптеген модификациялар орын алды (Cурет 2b).Бір қызығы, біз гистидиннің модификациясын ғана байқадық, бұл басқа аминқышқылдарына қарағанда тотыққан гистидиннің анилин зондтарына жоғары реактивтілігіне байланысты.Гистидиннің синглетті оттегімен тотығуының жарияланған механизміне сәйкес,21,33 ұсынылған дельта-массалық құрылымы +229 Да екі тотығудан кейін 3-зондтың 2-оксо-гистидинмен аддукциясына сәйкес келеді, ал +247 Да гидролиз өнімі болып табылады. +229 Da (Қосымша 5-сурет).MS2 спектрін бағалау y және b иондарының көпшілігін, оның ішінде модификацияланған фрагмент иондарын (y және b) идентификациялаудың жоғары сенімділігін көрсетті (2c-сурет).PDPL-модификацияланған гистидиндердің жергілікті тізбегінің контекстік талдауы ±1 позициялардағы шағын гидрофобты қалдықтар үшін қалыпты мотивті артықшылықты анықтады (Қосымша 4b-сурет).Орташа алғанда, бір ақуызға 1,4 гистидин анықталды және бұл маркерлердің орындары еріткіш қол жетімді бетінің ауданы (SASA) және салыстырмалы еріткіштің қолжетімділігі (RSA) талдауы арқылы анықталды (қосымша 4c,d сурет).
MSFragger қолдайтын FragPipe есептеу платформасын пайдаланып қалдық селективтілікті зерттеуге арналған бейтарап жұмыс процесі.Бөлінетін сілтемелер стрептавидин шайырынан модификацияланған пептидтердің фотобөлінуіне мүмкіндік беру үшін Click химиясында қолданылады.Көптеген модификацияларды, сондай-ақ тиісті қалдықтарды анықтау үшін ашық іздеу басталды.b Протеомда болатын модификациялар массасын тағайындаңыз.PSM пептидтік картасы.c 3-зондпен модификацияланған гистидин учаскелерінің MS2 спектрлік аннотациясы. Өкілдік мысал ретінде 3-зондпен ковалентті реакция модификацияланған амин қышқылына +229,0938 Да қосылды.d PDPL маркерлерін сынау үшін пайдаланылатын мутация талдауы.PRDX3 (H155A, H225A) және PRDX1 (H10A, H81A, H169A) туға қарсы анықтау үшін жабайы типтегі плазмидалармен трансфекцияланды.e Синтетикалық пептид 3 зондтың қатысуымен тазартылған miniSOG-мен әрекеттесті және LC-MS спектрінде Δm +247 және +229 сәйкес өнімдер белгіленді.f miniSOG-6xHis-тегімен және анти-6xHis антиденелерімен модельденген ақуыздың ақуызға in vitro әрекеттесуі.Антибиотин (стрептавидин-HRP) және жарықтың әсер ету уақытына байланысты 3-зондпен белгіленген miniSOG-6xHis/anti-6xHis антидене кешендерінің тышқанға қарсы Вест-блот талдауы.Жеке ақуыздарға арналған белгілер сәйкес молекулалық салмақта көрсетіледі: LC антиденелерінің жеңіл тізбегі, HC антиденелерінің ауыр тізбегі.Бұл эксперименттер ұқсас нәтижелермен кем дегенде екі рет тәуелсіз қайталанды.
Таңбалау орнын биохимиялық тексеру үшін масс-спектрометрия арқылы анықталған PRDX3 және PRDX1 гистидиннен аланинге өзгертілді және трансфекциялық талдаулардағы жабайы түрімен салыстырылды.PDPL нәтижелері мутация таңбалауды айтарлықтай төмендететінін көрсетті (2d-сурет).Сонымен қатар, ашық іздеуде анықталған пептидтік тізбектер синтезделді және LC-MS арқылы анықталған кезде +247 және +229 Да массалық ығысуы бар өнімдерді беретін 3 зонд пен көк жарықтың қатысуымен тазартылған miniSOG көмегімен in vitro реакциясына түсті (Cурет 1). 2e).).Әрекеттесетін проксимальды ақуыздарды miniSOG фотоактивациясына жауап ретінде in vitro таңбалау мүмкіндігін тексеру үшін біз miniSOG-6xHis протеині мен оның анти-моноклональды антиденесінің in vitro арасындағы әрекеттесу арқылы жасанды жақындық талдауын жасадық (2f-сурет).Бұл талдауда біз miniSOG көмегімен ауыр және жеңіл антиденелер тізбектерінің проксимальды таңбалануын күттік.Шындығында, тінтуірге қарсы (anti-6xHis таңбаланған антидененің ауыр және жеңіл тізбектерін тану) және стрептавидин Батыс дақтары ауыр және жеңіл тізбектердің күшті биотинилденуін көрсетті.Атап айтқанда, біз 6xHis тегіне және жеңіл және ауыр тізбектер арасындағы көлденең байланыстарға байланысты miniSOG автобиотинизациясын байқадық, бұл лизин мен 2-оксо-гистидиннің проксимальды реакциясы арасындағы бұрын сипатталған алшақтықпен байланысты болуы мүмкін.Қорытындылай келе, PDPL гистидинді жақындыққа тәуелді түрде өзгертеді деген қорытындыға келдік.
Біздің келесі мақсатымыз in situ таңбалаудың ерекшелігін тексеру үшін субклеткалық протеомды сипаттау болды.Сондықтан, біз HEK293T жасушаларының ядросында, митохондриялық матрицада немесе сыртқы ER мембранасында miniSOG тұрақты түрде экспрессияландық (3a-сурет).Гельді флуоресценция талдауы үш субклеткалық жерде таңбаланған көп жолақтарды, сондай-ақ әртүрлі таңбалау үлгілерін анықтады (Cурет 3b).Флуоресцентті бейнелеу талдауы PDPL жоғары ерекшелігін көрсетті (3c-сурет).PDPL жұмыс процесі флуоресценциялық микроскопияны пайдаланып субклеткалық протеомдарды анықтау үшін родаминдік бояғыштармен басу реакцияларымен жалғасты және PDPL сигналдары PDPL жоғары дәлдігін растайтын DAPI, митохондриялық трекерлер немесе ER трекерлерімен колокализацияланды.Үш органелла орналасуы үшін avidin western blot көмегімен PDPL мен TurboID-ті жанама салыстыру PDPL олардың тиісті басқару элементтерімен салыстырғанда нақтырақ таңбаланғанын көрсетті.PDPL жағдайында көбірек PDPL таңбаланған ақуыздарды көрсететін көбірек таңбаланған жолақтар пайда болды (Қосымша сурет 6a-d).
miniSOG арқылы органеллаға тән протеомды таңбалаудың схемалық көрінісі.miniSOG митохондриялық матрицаны адамның COX4 (мито-miniSOG) N-терминалына 23 амин қышқылдарына біріктіру арқылы, ядроны H2B (ядро-miniSOG) біріктіру арқылы және ER мембранасының цитоплазмалық жағы (ER-miniSOG) арқылы Sec61β арқылы бағыттайды. ).Көрсеткіштерге гельді бейнелеу, конфокальды бейнелеу және масс-спектрометрия жатады.b Органеллаға тән үш PDPL профилінің репрезентативті гельдік кескіндері.CBB Coomassie Brilliant Blue.c V5 (қызыл) деп белгіленген антиденемен анықталған әртүрлі субклеткалық локализациясы бар miniSOG тұрақты экспрессиялайтын HEK293T жасушаларының репрезентативті конфокальды кескіндері.Субклеткалық маркерлер митохондриялар мен ER (жасыл) үшін қолданылады.PDPL жұмыс процесі Cy3-азидті клик химиясын пайдаланып miniSOG (сары) таңбаланған субклеткалық протеомдарды анықтауды қамтиды.Масштаб жолағы: 10 мкм.d Таңбаланбаған сандық анықтау (n = 3 тәуелсіз биологиялық эксперимент) арқылы сандық анықталған әртүрлі органеллалардағы PDPL-белгіленген протеомдардың жанартаулық сызбалары.Екі құйрықты Студенттің t-сынағы жанартау учаскелерінде қолданылды.Теріс бақылау ретінде HEK293T жабайы түрі қолданылды. Айтарлықтай өзгерген ақуыздар қызыл түспен бөлектеледі (p < 0,05 және >2 есе ион қарқындылығының айырмашылығы). Айтарлықтай өзгерген ақуыздар қызыл түспен бөлектеледі (p < 0,05 және >2 есе ион қарқындылығының айырмашылығы). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 және >2-кратная разница в интенсивности ионов). Айтарлықтай өзгерген ақуыздар қызыл түспен бөлектеледі (p <0,05 және ион қарқындылығындағы >2 есе айырмашылық).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Айтарлықтай өзгерген белоктар қызыл түспен бөлектеледі (p < 0,05 және > иондық күштің 2 есе айырмашылығы).HEK293T-miniSOG үшін маңызды, бірақ HEK293T үшін маңызды емес қатысты ақуыздар жасыл түспен көрсетілген.e Тәжірибелерден алынған протеомдық деректер жиынтығының ерекшелігін талдау d.Әрбір органелладағы статистикалық маңызды ақуыздардың жалпы саны (қызыл және жасыл нүктелер) жоғарғы жағында белгіленген.Гистограммалар MitoCarta 3.0, GO талдау және A. Ting және т.б. негізінде органеллаларда локализацияланған ақуыздарды көрсетеді.адамдар.Митохондриялар, ядролар және ER үшін бөлек деректер жиыны.Бұл эксперименттер ұқсас нәтижелермен кем дегенде екі рет тәуелсіз қайталанды.Шикі деректер бастапқы деректер файлдары түрінде беріледі.
Гель және бейнелеу нәтижелері ынталандырылған, әрбір органеллада анықталған протеомды анықтау үшін жапсырмасыз сандық анықтау қолданылды (Қосымша деректер 2).Трансфекцияланбаған HEK293T фондық маркерлерді алып тастау үшін теріс бақылау ретінде пайдаланылды. Жанартау сюжетін талдау айтарлықтай байытылған ақуыздарды (p < 0,05 және >2 есе ион қарқындылығы), сондай-ақ тек miniSOG-экспрессиялайтын сызықтарда болатын синглтонды ақуыздарды көрсетті (3d-сурет қызыл және жасыл нүктелер). Жанартау сюжетін талдау айтарлықтай байытылған ақуыздарды (p < 0,05 және >2 есе ион қарқындылығы), сондай-ақ тек miniSOG-экспрессиялайтын сызықтарда болатын синглтонды ақуыздарды көрсетті (3d-сурет қызыл және жасыл нүктелер). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), және тағы басқа одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG, зеленический только (рис. только). Жанартау сюжетін талдау айтарлықтай байытылған ақуыздарды (p<0,05 және >2 есе ион қарқындылығы), сондай-ақ тек miniSOG-экспрессиялайтын сызықтарда болатын жалғыз белоктарды көрсетті (3d-сурет, қызыл және жасыл нүктелер)... Анализ графика вулкана выявил значительно обогощенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отделные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Жанартау сюжетін талдау айтарлықтай байытылған ақуыздарды (p<0,05 және >2x иондық күші), сондай-ақ тек miniSOG экспрессия сызығында болатын жалғыз ақуыздарды анықтады (3d-суреттегі қызыл және жасыл нүктелер).Осы деректерді біріктіре отырып, біз сәйкесінше 1364, 461 және 911 статистикалық маңызды ядролық, митохондриялық және ER сыртқы мембрана ақуыздарын анықтадық.Органелла-локализацияланған PDPL дәлдігін талдау үшін біз MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) талдауын және A. Ting және т.б.73,4, 78,5 және 73,0% дәлдікке сәйкес келетін анықталған ақуыздардың органелла ерекшелігін тексеру үшін митохондриялар, ядролар және ER үшін деректер жинағы8 пайдаланылды (3e-сурет).PDPL ерекшелігі PDPL органеллаларға тән протеомдарды анықтау үшін тамаша құрал екенін растайды.Атап айтқанда, анықталған митохондриялық ақуыздардың субмитохондриялық талдауы ұсталған протеоманың негізінен матрицада және ішкі мембранада (тиісінше 226 және 106) таралғанын көрсетті, бұл анықталған митохондриялық ақуыздардың жалпы санының 91,7% (362) құрайды.PDPL жоғары деңгейі қосымша расталды (Қосымша 7а-сурет).Сол сияқты, субядролық талдау басып алынған протеоманың негізінен ядрода, нуклеоплазмада және ядрошықта таралғанын көрсетті (Қосымша 7b-сурет).Ядролық локализация сигналының пептидімен (3xNLS) ядролық протеомдық талдау H2B конструкциясына ұқсас дәлдікті көрсетті (Қосымша 7c-h сурет).PDPL маркерінің ерекшелігін анықтау үшін ядролық ламинин А дискретті локализацияланған POI7 тұзағы ретінде таңдалды.PDPL айтарлықтай байытылған 36 протеинді анықтады, оның ішінде 12 ақуыз (30,0% ламинді қоса) String дерекқорымен түсіндірілетін жақсы сипатталған ламин А өзара әрекеттесетін белоктар, BioID әдісінен (122 ақуыз) жоғары пайызбен 28/28. , 22,9 %) 7. Біздің әдіс белсендірек синглетті оттегінің арқасында мүмкін болған шектеулі таңбалау аймақтарына байланысты аз белоктарды анықтады.GO талдауы анықталған белоктар негізінен нуклеоплазмада (26), ядролық мембранада (10), ядролық мембранада (9) және ядролық кеуектерде (5) орналасқанын көрсетті.Бұл ядролық локализацияланған ақуыздар PDPL ерекшелігін одан әрі көрсете отырып, байытылған ақуыздардың 80% құрады (Қосымша 8a-d сурет).
PDPL-дің органеллалардағы жақындықты белгілеу мүмкіндігін анықтағаннан кейін, біз PDPL POI байланыстыратын серіктестерді талдау үшін қолданыла алатынын тексердік.Атап айтқанда, біз цитозолдық ақуыздардың PDPL талдауын анықтауға тырыстық, олар жоғары динамикалық табиғатына байланысты мембраналық локализацияланған аналогтарына қарағанда қиынырақ нысана болып саналады.Bromodomain және экстратерминальды (BET) протеині BRD4 әртүрлі аурулардағы негізгі рөлі үшін біздің назарымызды аударды 35, 36 .BRD4 түзетін кешен транскрипциялық коактиватор және маңызды емдік мақсат болып табылады.c-myc және Wnt5a транскрипция факторларының экспрессиясын реттей отырып, BRD4 жедел миелоидты лейкоз (AML), бірнеше миелома, Буркитт лимфомасы, тоқ ішек қатерлі ісігі және қабыну ауруларының негізгі детерминанты болып табылады37,38.Сонымен қатар, кейбір вирустар папилломавирус, АИТВ және SARS-CoV-236,39 сияқты вирустық және жасушалық транскрипцияны реттеу үшін BRD4-ке бағытталған.
PDPL көмегімен BRD4 өзара әрекеттесу картасын жасау үшін біз miniSOG BRD4 қысқа N- немесе C-терминал изоформасымен біріктірдік.Протеомдық нәтижелер екі құрылымның жоғары қабаттасу дәрежесін көрсетті (қосымша 9a-сурет).miniSOG-H2B-мен анықталған ядролық протеома BRD4-пен әрекеттесетін ақуыздардың 77,6% қамтиды (Қосымша 9b-сурет).Содан кейін маркер радиусын реттеу үшін әртүрлі жарықтандыру уақыттары (2, 5, 10, 20 мин) пайдаланылды (4а-сурет және қосымша деректер 3).Қысқа фотопериодтарда PDPL негізінен тікелей байланыстыратын серіктестерді белгілейді, ал ұзағырақ кезеңдер қысқа фотоактивация кезеңдерінде анықталған ақуыздарды, сондай-ақ таңбалау кешендеріндегі жанама нысандарды қамтиды деген қорытындыға келдік.Шын мәнінде, біз іргелес уақыт нүктелері арасында қатты сәйкестік таптық (2 және 5 минут үшін 84,6%; 5 және 10 минут үшін 87,7%; 10 және 20 минут үшін 98,7%) (сурет 4b және Қосымша 9c сурет).Барлық эксперименттік топтарда біз тек BRD4 өзін-өзі таңбалауын ғана емес, сонымен қатар MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A және HMGB1 сияқты бірнеше белгілі мақсатты жол дерекқорында түсіндірдік.Бұл нысандардың иондық күші әсер ету уақытына пропорционалды (4c-сурет және қосымша 9d-сурет).2 минуттық топта анықталған ақуыздардың GO талдауы анықталған ақуыздардың ядрода локализацияланғанын және хроматинді қайта құруға және РНҚ полимераза қызметіне қатысқанын көрсетті.Ақуыздың молекулалық қызметі BRD4 функциясына сәйкес келетін хроматинді байланыстыру немесе транскрипциялық коактивациямен байытылды (4d-сурет).Жолдық дерекқорды қолдайтын ақуыздың өзара әрекеттесу талдауы BRD4 және HDAC байланыстыратын ацетилденген гистондарға сәйкес келетін SIN3A, NCOR2, BCOR және SAP130 (4e-сурет және қосымша сурет 9e) сияқты BRD4 және HDAC отбасының өзара әрекеттесетін кешендері арасындағы жанама өзара әрекеттесулердің бірінші деңгейін анықтады. ..Сонымен қатар, LC-MS/MS анықтаған өкілді мақсаттар, соның ішінде Sin3A, NSUN2, Fus және SFPQ, Western blotting арқылы расталды (4f-сурет).Жақында BRD4 қысқа изоформасы сұйық-сұйық фазаны бөлу (LLPS) қасиеттері бар ядролар түзетіні туралы хабарланды.РНҚ байланыстыратын Fus және SFPQ ақуыздары әртүрлі жасушалық процестердің LLPS делдалдығы болып табылады және мұнда тіркелмеген BRD4 байланыстыратын ақуыздар ретінде анықталған.BRD4 және SFPQ арасындағы өзара әрекеттесу ко-иммунопреципитация (ко-IP) эксперименттерімен расталды (4g-сурет), бұл қосымша зерттеуге лайық BRD4 арқылы сұйық-сұйық фазаны бөлудің басқа механизмін ұсынады.Біріктірілген бұл нәтижелер PDPL белгілі BRD4 әрекеттесетін, сондай-ақ белгісіз байланыстырушы ақуыздарды анықтау үшін тамаша платформа екенін көрсетеді.
a miniSOG арқылы BRD4 жақындық таңбалауының схемалық көрінісі, экспозиция уақыты: 2, 5, 10 және 20 мин.b Әр түрлі жарықтандыру уақытында анықталған ақуыздардың қабаттасуы.HEK293T-miniSOG-BRD4-те анықталған ақуызды байыту жабайы түрдегі HEK293T-мен салыстырғанда статистикалық маңызды болды.c Белгіленбеген экспозиция уақыты ішінде белгілі BRD4-байланыстыратын протеиндердің санын анықтау кезіндегі ион қарқындылығы.n = 3 биологиялық тәуелсіз үлгі.Деректер орташа ± стандартты ауытқу ретінде берілген.d 2 минуттық топта анықталған белоктардың гендік онтологиялық талдауы (GO).Алғашқы он GO шарты тізімделген.Көпіршіктер GO терминінің санатына сәйкес боялады және көпіршік өлшемі әр терминде табылған ақуыздар санына пропорционалды.e BRD4-пен әрекеттесетін ақуыздардың жолдық талдауы.Сары шеңберлер тікелей желім, ал сұр шеңберлер жанама желімнің бірінші қабаты.Қызыл сызықтар эксперименталды түрде анықталған өзара әрекеттесулерді, ал көк сызықтар болжамды өзара әрекеттесуді білдіреді.f LC-MS/MS ішінде анықталған BRD4 өкілі байланыстыру мақсаттары Western blotting арқылы тексерілді.g Бірлескен иммунопреципитация эксперименттері SFPQ мен BRD4 арасындағы өзара әрекеттесуді растайды.Бұл эксперименттер ұқсас нәтижелермен кем дегенде екі рет тәуелсіз қайталанды.Шикі деректер бастапқы деректер файлдары түрінде беріледі.
Тіркелмеген POI-байланысты нысандарды анықтаудан басқа, біз PDPL ферменттер үшін субстраттарды анықтау үшін қолайлы болады деп болжаймыз, бұл тіркелмеген субстраттарға түсініктеме беру үшін үлкен кешендердегі жанама байланыстырушы ақуыздардың сипаттамасын қажет етеді.Паркин (PARK2 арқылы кодталған) E3 лигаза болып табылады және паркиндегі мутациялар аутосомды-рецессивті кәмелетке толмаған Паркинсон ауруын (AR-JP) тудыратыны белгілі.Сонымен қатар, паркин митофагия (митохондриялық аутофагия) және реактивті оттегі түрлерін жою үшін маңызды деп сипатталған.Дегенмен, бірнеше паркин субстраттары анықталғанымен, бұл аурудағы паркиннің рөлі түсініксіз.Оның сипатталмаған субстраттарына түсініктеме беру үшін PDPL паркиннің N- немесе C-терминусына miniSOG қосу арқылы сыналған.Жасушалар PINK1-Паркин жолы арқылы паркинді белсендіру үшін карбонил цианиді протонды тасымалдаушы м-хлорфенилгидразонмен (CCCP) өңделген.Біздің BRD4 PDPL нәтижелерімен салыстырғанда, паркин N-терминусының синтезі C-терминусының үлкен бөлігін (210-ның 177-сі) қамтығанымен, мақсатты ақуыздардың үлкен жинағын анықтады (5a,b және Қосымша деректер 4).нәтиже N-терминал тегтері Parkin44 қатесін белсендіруі мүмкін деген есептерге сәйкес келеді.Бір таңқаларлығы, Parkin43 үшін жарияланған AP-MS нәтижелері бар деректерімізде тек 18 қабаттасатын белоктар болды, бұл жасуша желілері мен протеомиканың жұмыс ағындары арасындағы айырмашылықтарға байланысты болуы мүмкін.Екі әдіспен анықталған төрт белгілі ақуызға (ARDM1, HSPA8, PSMD14 және PSMC3) қосымша (5c-сурет)43.LC-MS/MS нәтижелерін әрі қарай растау үшін PDPL өңдеу және одан кейінгі Western Blotting HEK293T ата-аналық жасуша талдауының нәтижелерін және тұрақты N-терминал паркин сызығын салыстыру үшін пайдаланылды.Бұрын белгісіз болған CDK2, DUT, CTBP1 және PSMC4 нысандары DNAJB1 белгілі байланыстырғышпен сыналған (5d-сурет).
Паркиннің N- немесе C-терминусына біріктірілген тұрақты экспрессиялық miniSOG бар HEK293T жасушаларындағы паркинмен әрекеттесетін ақуыздардың жанартау сызбасы (n = 3 тәуелсіз биологиялық эксперимент).Екі құйрықты Студенттің t-сынағы жанартау учаскелерінде қолданылды.Теріс бақылау ретінде HEK293T пайдаланылды. Айтарлықтай өзгерген ақуыздар қызыл түспен бөлектеледі (p < 0,05 және >2 есе ион қарқындылығының айырмашылығы). Айтарлықтай өзгерген ақуыздар қызыл түспен бөлектеледі (p < 0,05 және >2 есе ион қарқындылығының айырмашылығы). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 және >2-кратная разница в интенсивности ионов). Айтарлықтай өзгерген ақуыздар қызыл түспен бөлектеледі (p <0,05 және ион қарқындылығындағы >2 есе айырмашылық).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Айтарлықтай өзгерген белоктар қызыл түспен бөлектеледі (p < 0,05 және > иондық күштің 2 есе айырмашылығы).HEK293T-miniSOG үшін маңызды, бірақ HEK293T үшін маңызды емес қатысты ақуыздар жасыл түспен көрсетілген.b Венн диаграммасы N-терминал және C-терминал құрылымдары арасындағы қабаттасатын ақуыздарды көрсетеді.N-терминалды тегтер паркинді белсенді түрде белсендіреді және одан бетер танымал болуы мүмкін.c PDPL және AP-MS арасындағы қабаттасатын ақуыздарды көрсететін Венн диаграммасы.Белгілі интеракторлар тізімделген, соның ішінде 18 қабаттасатын ақуыздың 4-і және PDPL-де арнайы анықталған 159 ақуыздың 11-і.d LC-MS/MS арқылы анықталған өкілдік мақсаттар Western blotting арқылы тексерілді.e Ssu72 және SNW1 тіркелмеген паркиндік субстраттар ретінде анықталды.Бұл FLAG белгісі бар ақуыз плазмидалары HEK293T және HEK293T-Parkin-miniSOG трансфекциясынан кейін әртүрлі уақыт нүктелерінде CCCP өңдеуден өтті.Деградация Паркиннің артық экспрессия сызығында айқынырақ болды.f MG132 протеасома ингибиторын пайдалану арқылы Ssu72 және SNW1 деградация процесі протеазома-убиквитинация арқылы жүзеге асатыны расталды.Бұл эксперименттер ұқсас нәтижелермен кем дегенде екі рет тәуелсіз қайталанды.Шикі деректер бастапқы деректер файлдары түрінде беріледі.
Атап айтқанда, PDPL анықтаған ақуыздар паркинді байланыстыратын ақуыздарды және олардың субстраттарын қамтуы керек.Тіркелмеген паркин субстраттарын анықтау үшін біз жеті анықталған ақуызды (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 және SNW1) және трансфекцияланған плазмидаларды таңдап алдық, бұл гендерді қалыпты HEK293T әсеріне ұшырату және miniSOG-Parkin's HEK293CP өңдеуінен кейін тұрақты экспрессиялау үшін.Ssu72 және SNW1 ақуыздарының деңгейі тұрақты miniSOG-Parkin сызығында айтарлықтай төмендеді (5e-сурет).CCCP-мен 12 сағат бойы өңдеу екі субстраттың да айтарлықтай нашарлауына әкелді.Ssu72 және SNW1 ыдырауы протеазома-убиквитинация арқылы реттелетінін зерттеу үшін протеазоманың белсенділігін тежеу ​​үшін MG132 протеазома ингибиторы қосылды және іс жүзінде олардың ыдырау процесі тежелгенін анықтадық (5f-сурет).Қосымша субстратсыз мақсаттар LC-MS/MS көмегімен дәйекті нәтижелерді көрсеткен Western blotting (Қосымша 10-сурет) көмегімен Паркин интеракторлары ретінде расталды.Қорытындылай келе, PDPL жұмыс процесін мақсатты ақуызды трансфекциялауды тексерумен біріктіру тіркелмеген E3 лигаза субстраттарын анықтауға мүмкіндік береді.
Біз кеңістікте және уақытта өзара әрекеттесетін POI-ларды анықтауға мүмкіндік беретін ортақ жақындық таңбалау платформасын әзірледік.Платформа miniSOG фотосенсибилизатор протеиніне негізделген, ол небәрі 12 кДа, жетілген APEX2 ферментінің (27 кДа) жартысынан аз және TurboID өлшемінен (35 кДа) үштен бір бөлігін құрайды.Кішігірім өлшем белок интерактомдарын зерттеуге арналған қолданбалардың ауқымын айтарлықтай кеңейтуі керек.Генетикалық кодталған белоктар немесе шағын молекулалар болсын, қосымша фотосенсибилизаторларды одан әрі зерттеу синглет оттегінің кванттық шығымдылығын арттыру және осы тәсілдің сезімталдығын кеңейту үшін қажет.miniSOG бағдарламасының ағымдағы нұсқасы үшін жақындық маркерлерін белсендіру үшін көк жарықтандыру арқылы жоғары уақытша ажыратымдылыққа қол жеткізуге болады.Бұған қоса, ұзағырақ экспозиция уақыты синглеттік оттегінің үлкен «бұлтын» шығарды, нәтижесінде дистальды гистидин қалдықтарының модификациясы, таңбалау радиусының жоғарылауы және PDPL кеңістіктік ажыратымдылығын дәл реттеу мүмкіндігі пайда болды.Біз сондай-ақ сигнал-фон қатынасын арттыру үшін жеті химиялық зондты сынап көрдік және осы тәсілдің артындағы молекулалық механизмді зерттедік.Бейтарап ашық іздеумен біріктірілген TOP-ABPP жұмыс процесі модификациялардың тек гистидиндерде болғанын және цикл аймағында гистидиндерге қалыпты артықшылықты қоспағанда, гистидиннің жоғарылауы үшін дәйекті микроортаның байқалмағанын растады.
PDPL сонымен қатар протеом спецификасы мен қамтуы кем дегенде басқа жақындық таңбалауымен және органеллаға тән химиялық зонд әдістерімен салыстырылатын субклеткалық протеомдарды сипаттау үшін пайдаланылды.Жақындық маркерлері сонымен қатар беткі, лизосомалық және секретоммен байланысты протеомаларды сипаттау үшін сәтті қолданылды46,47.Біз PDPL осы субклеткалық органеллалармен үйлесімді болады деп сенеміз.Сонымен қатар, біз динамикалық қасиеттеріне және уақытша өзара әрекеттесуге қатысуына байланысты мембранамен байланысқан ақуыздарға қарағанда күрделірек цитозолдық ақуызды байланыстыру мақсаттарын анықтау арқылы PDPL-ге қарсы шықтық.PDPL екі ақуызға, транскрипциялық коактиватор BRD4 және аурумен байланысты лигаза E3 Parkin үшін қолданылды.Бұл екі ақуыз іргелі биологиялық функциялары үшін ғана емес, сонымен қатар клиникалық маңыздылығы мен емдік потенциалы үшін таңдалды.Осы екі POI үшін белгілі байланыстырушы серіктестер, сонымен қатар тіркелмеген мақсаттар анықталды.Атап айтқанда, фазаның бөлінуімен байланысты SFPQ ақуызы co-IP арқылы расталды, бұл BRD4 (қысқа изоформа) LLPS реттейтін жаңа механизмді көрсетуі мүмкін.Сонымен қатар, біз Паркин субстраттарын сәйкестендіру жанама желімдерді сәйкестендіруді қажет ететін сценарий деп санаймыз.Біз екі белгісіз паркин субстратын анықтадық және олардың убиквитинация-протеазомдық жол бойында деградациясын растадық.Жақында гидролаза субстраттарын ферменттермен ұстау арқылы анықтау үшін механизмге негізделген ұстау стратегиясы жасалды.Бұл өте күшті әдіс болғанымен, ол үлкен кешендердің түзілуіне қатысатын субстраттарды талдауға жарамайды және фермент пен субстрат арасында коваленттік байланыстың түзілуін қажет етеді.Біз PDPL басқа ақуыз кешендері мен ферменттер тұқымдастарын, мысалы, деубикитиназа және металлопротеаза отбасыларын зерттеу үшін кеңейтілуі мүмкін деп күтеміз.
SOPP3 деп аталатын miniSOG жаңа нысаны жақсартылған синглет оттегі өндірісімен әзірленді.Біз miniSOG-ті SOPP3-пен салыстырып, сигнал-шуыл қатынасы өзгеріссіз қалғанымен, таңбалаудың жақсарғанын таптық (Қосымша 11-сурет).Біз SOPP3 оңтайландыруы (мысалы, бағытталған эволюция арқылы) қысқа жарық уақытын қажет ететін тиімдірек фотосенсибилизатор ақуыздарына әкеледі және осылайша неғұрлым динамикалық жасушалық процестерді түсіруге мүмкіндік береді деп болжадық.Атап айтқанда, PDPL-дің қазіргі нұсқасы ұялы ортамен шектеледі, өйткені ол көк жарықты қажет етеді және терең тіндерге өте алмайды.Бұл мүмкіндік оны жануарлар моделін зерттеуде пайдалануды болдырмайды.Дегенмен, оптогенетиканың PDPL-мен үйлесуі жануарларды, әсіресе миды зерттеуге мүмкіндік бере алады.Бұған қоса, басқа инженерлік инфрақызыл фотосенсибилизаторлар да бұл шектеуді жояды.Қазір бұл бағытта зерттеу жұмыстары жүргізілуде.
HEK293T жасуша желісі ATCC (CRL-3216) алынды.Жасуша желісі микоплазмалық инфекцияға теріс сыналған және 10% ұрықтың ірі қара сарысуымен (FBS, Vistech, #SE100-B) және 1% пенициллин/стрептомицинмен (Hyclone, #SV30010) толықтырылған DMEM (Thermo, #C11995500BT) ішінде өсірілді.жылы өскен.
3-Аминофенилен (3-үлгі) және (4-этинилфенил)метанамин (4-үлгі) Bidepharm компаниясынан сатып алынды.Пропиламин (зонд 2) Energy-chemicals компаниясынан сатып алынды.N-(2-Аминофенил)пент-4-намид (1-зонд) жарияланған әдістерге сәйкес синтезделді.
Қосымша 1-кестеде осы зерттеуде пайдаланылған генетикалық құрылымдар берілген.miniSOG және KillerRed тізбегі П.Зу (Пекин университеті) сыйлық плазмидасынан клондалған.Митохондриялық матрицаның мақсатты тізбегі COX4-тің 23 N-терминалды аминқышқылдарынан алынған және Гибсон жинағы (Beyotime, #D7010S) арқылы көрсетілген векторларға клондалған.Эндоплазмалық ретикулумның мембранасы мен ядросын нысанаға алу үшін HEK293T жасушаларының cDNA кітапханасынан ПТР арқылы күшейтілген SEC61B адам ДНҚ (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) және H2B ДНҚ (Д. Лин, Шэньчжэнь шығанағы зертханасы сыйға тартты) және жоғарыда айтылғандай клондалған.Егер басқаша көрсетілмесе, трансфекция және тұрақты жасуша линияларын құру үшін пайдаланылатын басқа ақуыз гендер HEK293T жасуша cDNA кітапханасынан ПТР күшейтілді.G3S (GGGS) және G4S (GGGGS) жем ақуызы мен miniSOG арасындағы байланыстырушы ретінде пайдаланылды.Бұл біріктіру конструкцияларына V5 эпитоптық тегі (GKPIPNPLLGLDST) қосылды.Сүтқоректілердегі экспрессия және тұрақты жасуша желісін құру үшін miniSOG біріктіру құрылымы pLX304 лентивирустық векторына субклондалған.Бактериялық экспрессия үшін miniSOG C-терминусында 6xHis деп белгіленген pET21a векторына клондалған.
HEK293T жасушалары алты шұңқырлы пластиналарға бір шұңқырға 2,0 x 105 ұяшыққа егілді және 24 сағаттан кейін рекомбинантты лентивирустық плазмидтермен (2,4 мкг pLX304) және вирустық орау плазмидаларымен (1,5 мкг psPAX2 және 1,2 мкг pMD02.02 көмегімен) трансфекцияланды. , #C0533), шамамен 80% біріктіру.Түнгі трансфекциядан кейін орта ауыстырылды және тағы 24 сағат бойы инкубацияланды.Вирусты жинау 24, 48 және 72 сағаттан кейін жүргізілді.Мақсатты жасуша линияларын жұқтырмас бұрын вирустық орта 0,8 мкм сүзгі арқылы сүзілді (Merck, #millex-GP) және полибрен (Solarbio, #H8761) 8 мкг/мл концентрацияға қосылды.24 сағаттан кейін ортаны өзгерту арқылы жасушалардың қалпына келуіне мүмкіндік берілді.Жасушалар төменгі қатаң таңдау ретінде алғашқы үш үзінді үшін 5 мкг/мл бластицидин (Solarbio, №3513-03-9) арқылы таңдалды.Содан кейін келесі үш өту үшін неғұрлым қатаң режим ретінде 20 мкг/мл қолданылды.
Жасушалар 12 шұңқырлы камераларға (Ibidi, №81201) бір ұңғымаға шамамен 20 000 жасуша тығыздығымен себілді.HEK293T жасушаларының адгезиясын жақсарту үшін 37°C температурада фосфатты буферленген физиологиялық ерітіндіде (PBS, Sangon, #B640435) сұйылтылған 50 мкг/мл фибронектинді (Корнинг, №356008) қосыңыз.Камералар 1 сағат бойы алдын ала өңделді, содан кейін PBS көмегімен жойылды.24 сағаттан кейін жасушалар PBS-пен бір рет жуылды, 1 мМ зонд 3-пен жаңа Хэнкстің теңдестірілген тұз ерітіндісінде (HBSS, Gibco, №14025092) 37°C температурада 1 сағат бойы инкубацияланды, содан кейін көк жарық диодпен (460 нм) инкубацияланды. ).) бөлме температурасында 10 минут бойы сәулелендірілген.Осыдан кейін жасушалар екі рет PBS көмегімен жуылды және бөлме температурасында 15 минут бойы PBS (Sangon, #E672002) ішінде 4% формальдегидпен бекітілді.Бекітілген жасушалардан артық формальдегид PBS көмегімен үш рет жуу арқылы жойылды.Содан кейін жасушалар PBS ішінде 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) өткізгіштігімен өткізіліп, PBS көмегімен 3 рет жуылды.Содан кейін камераны алып тастаңыз және әрбір үлгіге 50 мкМ Cy3-азид (Аладдин, #C196720), 2 мм CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 мм BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) бар 25 мкл басу реакциясы қоспасын қосыңыз. және 0,5 мг/мл натрий аскорбаты (Аладдин, н. S105024) және бөлме температурасында 30 минут бойы инкубациялады.Жедел реакциядан кейін жасушалар 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) бар PBS көмегімен алты рет жуылды, содан кейін бөлме температурасында 30 минут бойы PBST ішінде 5% BSA (Abcone, #B24726) арқылы блокталды.
Коллокализациялық иммундық бояу үшін жасушалар көрсетілген шарттарға сәйкес бастапқы антиденелермен инкубацияланды: тышқан анти-V5 тегі mAb (1:500, CST, #80076), қоян анти-Hsp60 мАб (1:1000), ABclonal, #A0564), қоянның поликлональды калнексинге қарсы антиденесі (1:500, Abcam, #ab22595) немесе қоянның антиламиндік A/C моноклональды антиденесі (1:500; CST, №2032) түнде 4 °C температурада.PBST-пен 3 рет жуғаннан кейін жасушалар қайталама антиденелермен инкубацияланды: ешкі қоянға қарсы Alexa Fluor 488 (Термо, #A11034) 1:1000 сұйылтылған, ешкі тышқанға қарсы Alexa Fluor 594 (CST, №8889) 1:10000 сұйылтылған.сұйылту Бөлме температурасында 30 минут бойы сұйылтыңыз.Содан кейін жасушалар PBST көмегімен 3 рет жуылды және бөлме температурасында 10 минут бойы PBS ішінде DAPI (Thermo, #D1306) бояуымен боялады.PBS көмегімен 3 рет жуудан кейін жасушалар бейнелеу үшін PBS ішіндегі 50% глицеринге (Sangon, #A600232) жабылды.Иммунофлуоресцентті кескіндер ZEISS LSM 900 Airyscan2 конфокальды микроскоп және ZNE 3.5 бағдарламалық құралы арқылы алынды.
Синглетті оттекті флуоресцентті бейнелеу үшін Hanks HEPES буферіне 100 нМ Si-DMA қоспас бұрын жасушалар Hanks HEPES буферімен екі рет жуылды (DOJINDO, #MT05).Жарық әсерінен кейін жасушалар CO2 инкубаторында 37°C температурада 45 минут бойы инкубацияланды.Содан кейін жасушалар Hanks's HEPES буферімен екі рет жуылды және бөлме температурасында 10 минут бойы Hanks's HEPES буферінде Хоэхстпен қарсы боялды және ZEISS LSM 900 конфокальды микроскоптың көмегімен визуалды., #M36008) құрамында кальций мен магний бар HBSS буферінде.Жарық немесе доксорубицин (MCE, #HY-15142A) әсерінен кейін жасушалар CO2 инкубаторында 37°C температурада 10 минут бойы инкубацияланды, HBSS буферімен екі рет жуылды және бөлме температурасында HBSS буферінде Hoechst инкубацияланды.минут.Доксорубицин 30 минут ішінде 1% BSA бар HBSS-де 20 мкм доксорубицинмен өңделген жасушалар оң зондты бақылау ретінде пайдаланылды.Иммунофлуоресцентті суреттер Zeiss LSM 900 конфокальды микроскоптың көмегімен алынды.
Мито-miniSOG тұрақты экспрессиялайтын HEK293T жасушалары шамамен 30% тығыздықта 15 см ыдыстарға себілді.48 сағаттан кейін, ~80% қосылуға жеткенде, жасушалар PBS-пен бір рет жуылды, жаңа HBSS буферінде 1 мМ 3 зондымен 37°C температурада 1 сағат бойы инкубацияланды, содан кейін бөлмеде 10 минут бойы көк жарық диодымен жарықтандырылды. температура..Содан кейін жасушалар екі рет PBS-пен жуылды, қырылды және құрамында ЭДТА жоқ протеаза тежегіштері (MCE, #HY-K0011) бар мұзды салқын PBS буферінде қайта суспензияланды.Ұшты 1 минутқа ультрадыбыстық әсер ету арқылы ұяшықтар лизиске ұшырады (35% амплитудада 1 секунд қосулы және 1 секунд өшірулі).Алынған қоспа қоқыстарды кетіру үшін 4°C температурада 10 минут бойы 15,871 xg температурада центрифугаланған және үстіңгі заттың концентрациясы BCA протеинін талдау жинағы (Beyotime, #P0009) арқылы 4 мг/мл дейін реттелді.Жоғарыда көрсетілген лизаттың 1 мл-ін 0,1 мМ фотоыдырайтын биотин азидімен (Конфлюор, #BBBD-14), 1 мм TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 мМ TBTA лигандымен (Аладдин, #T162437) және SO4 incuM 1 м түбірімен біріктіріңіз. бөлме температурасында 1 сағатқа дейін айналдыру.Жылдам реакциядан кейін қоспаны 10 мл шыны құтыдағы алдын ала араластырылған ерітіндіге (MeOH:CHCl3:H2O = 4 мл:1 мл:3 мл) қосыңыз.Үлгілер араластырылды және бөлме температурасында 10 минут бойы 4500 г центрифугадан өтті.Төменгі және жоғарғы ерітінділер лақтырылды, тұнба екі рет 1 мл метанолмен жуылды және 4 ° C температурада 5 минут бойы 15871 × г центрифугалады.Тұнбаны еріту үшін 25 мМ аммоний бикарбонатына (ABC, Aladdin, н. A110539) 1 мл 8 М мочевина (Аладдин, н. U111902) қосыңыз.Үлгілер 55°C температурада 40 минут бойы 10 мм дитиотреитолмен (Sangon, #A100281 25 мм ABC) қалпына келтірілді, содан кейін қараңғыда бөлме температурасында 15 мм жаңа йодоацетамид (Sangon, #A600539) қосылды.30 минут ішінде алкилдеу..Реакцияны тоқтату үшін қосымша 5 мм дитиотреитол қосылды.Әрбір үлгі үшін шамамен 100 мкл NeutrAvidin агароза моншақтарын (Термо, №29202) 1 мл PBS көмегімен 3 рет жуу арқылы дайындаңыз.Жоғарыда көрсетілген протеом ерітіндісі 5 мл PBS сұйылтылған және бөлме температурасында 4 сағат бойы алдын ала жуылған NeutrAvidin агароздық түйіршіктерімен инкубацияланған.Содан кейін моншақтар 3 рет құрамында 0,2% SDS (Sangon, #A600485) бар 5 мл PBS, 1М несепнәрі бар 5 мл PBS 3 рет және 5 мл ddH2O бар 3 рет жуылды.Содан кейін моншақтар центрифугалау арқылы жиналды және құрамында 1 М мочевина, 1 мМ CaCl 2 (Macklin, #C805228) және 20 нг/мкл трипсин (Promega, #V5280) бар 200 мкл 25 мМ ABC-де қайта суспензияланды.Айналмалы түрде 37°C температурада түнде трипсинизациялаңыз.Реакция рН 2-3 жеткенше құмырсқа қышқылын (Термо, № A117-50) қосу арқылы тоқтатылды.Моншақтарды 3 рет 0,2% СДС бар 1 мл PBS, 1 М несепнәрі бар 1 мл PBS 3 рет, содан кейін 1 мл дистилденген сумен 3 рет жуды.Модификацияланған пептидтер 200 мкл 70% MeOH қолдану арқылы 90 минут бойы жеңіл лизис (365 нм) арқылы шығарылды.Центрифугадан кейін үстіңгі зат жиналды.Содан кейін моншақтарды 100 мкл 70% MeOH ерітіндісімен бір рет жуып, үстіңгі қабаттар біріктірілді.Үлгілер Speedvac вакуумдық концентраторында кептірілді және талдауға дейін -20°C температурада сақталды.
Синглетті оттегімен модификацияланған пептидтерді анықтау және олардың мөлшерін анықтау үшін үлгілер 0,1% құмырсқа қышқылында қайта ерітілді және 1 мкг пептидтер Tune нано ESI көзімен жабдықталған Orbitrap Fusion Lumos Tribrid масс-спектрометрі және 4.3 жеткізуші бағдарламалық құралының Xcalibur көмегімен талданды.Үлгілер 3 мкм C18 материалы (ReproSil-pur, #r13.b9.) бар 75 мкм × 15 см ішкі оралған капиллярлық бағанға бөлініп, EASY-nLC 1200 UHPLC жүйесіне (Термо) қосылды.Пептидтер сызықты 95 минуттық градиент хроматографиясы арқылы 8% В еріткішінен 50% еріткіш В (A = судағы 0,1% құмырсқа қышқылы, В = 80% ацетонитрилдегі құмырсқа қышқылы 0,1%), содан кейін сызықты түрде 98% B мин дейін ұлғайтылды. 6 мин ішінде 300 нл/мин ағын жылдамдығымен.Orbitrap Fusion Lumos деректерге байланысты толық MS сканерлеуі мен MS2 сканерлеуі арасында деректерді кезекпен жинайды.Шашырату кернеуі 2,1 кВ-қа орнатылды және иондарды тасымалдау капиллярының температурасы 320 ° C болды.MS спектрлері (350-2000 м/ц) 120 000 рұқсатпен, AGC 4 × 105 және максималды енгізу уақыты 150 мс жиналды.Әрбір толық сканерлеудегі ең көп таралған 10 еселенген зарядталған прекурсорлар HCD көмегімен 30% нормаланған соқтығыс энергиясы, 1,6 м/ц төрт полюсті оқшаулау терезесі және 30 000 ажыратымдылық параметрі бар фрагменттелді.5×104 және максималды енгізу уақыты 150 мс қолданатын тандемдік масс-спектрометрияға арналған AGC нысанасы.Динамикалық ерекшелік 30 секундқа орнатылған. MS/MS үшін тағайындалмаған немесе заряды 1+ және >7+ иондар қабылданбады. MS/MS үшін тағайындалмаған немесе заряды 1+ және >7+ иондар қабылданбады. МС/МС үшін неназначенные ион немесе ион с зарядом 1+ және >7+ были отклонены. MS/MS үшін тағайындалмаған иондар немесе заряды 1+ және >7+ иондар қабылданбады.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 МС/МС үшін неуказанные ион немесе ион с зарядами 1+ және >7+ были отклоны. MS/MS үшін анықталмаған иондар немесе зарядтары 1+ және >7+ иондар қабылданбады.
Шикі деректер MSFragger негізіндегі FragPipe есептеу платформасы арқылы өңделеді.Массалық ауытқулар және сәйкес аминқышқылдары прекурсордың массалық төзімділігі -150-ден 500 Да-ға дейінгі ашық іздеу алгоритмі арқылы анықталды.Содан кейін модификацияланған пептидтер PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo) +229,0964 және +247,1069 Да массалық өсімі бар гистидинді модификацияларды қолдану арқылы анықталды.
Біріктірілген miniSOG генін тұрақты экспрессиялайтын жасушалар 6 см ыдыстарға салынды.~80% қосылуға жеткенде, жасушалар HBSS (Gibco, #14025092) көмегімен бір рет жуылды, содан кейін 37°C температурада 1 сағат бойы HBSS ішінде химиялық зондтармен инкубацияланды және көк жарықпен жарықтандырылды.Бөлме температурасында 20 минут бойы 10 Вт жарық диоды.PDPL-ге қандай реактивті оттегі түрлері қатысатынын анықтау үшін, 0,5 мм С витамині (MCE, #HY-B0166), 5 мМ Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , Қосымша ретінде жасушаларға 100 мМ маннитол (Energy Chemical, №69-65-8), 100 мкм H2O2, 10 мМ NaN3 қосылды.Суық PBS көмегімен жуғаннан кейін жасушалар қырылып, 1,5 мл центрифуга түтіктеріне жиналды және EDTA жоқ 1x протеаза ингибиторы бар 200 мкл PBS ішінде (1 с және 1 с жоқ, амплитудасы 35%) 1 минут бойы ұшымен ультрадыбыстық әсерге ұшырады.Алынған қоспаны 4 °C температурада 10 минут бойы 15,871 × г центрифугалады және BCA протеинін талдау жинағы арқылы үстіңгі заттың концентрациясы 1 мг/мл-ге реттелді.Жоғарыда көрсетілген лизаттың шамамен 50 мкл 0,1 мМ родамин азидімен (Аладдин, н. T131368), 1 мм TCEP, 0,1 мМ TBTA лигандымен және 1 мм CuSO4 1 сағат бойы бөлме температурасында төменнен жоғарыға қарай айналдыру арқылы инкубацияланды.Клик реакциясынан кейін ацетонмен тұндыру үлгілерге 250 мкл алдын ала салқындатылған ацетон қосып, -20°C температурада 20 минут инкубациялау және 4°C температурада 10 минут бойы 6010×g центрифугалау арқылы жүзеге асырылды.Түйіршікті жинап, 50 мкл 1x Лаэммли буферінде 95 °C температурада 10 минут қайнатыңыз.Содан кейін үлгілер SDS-PAGE ұзын гельдерінде талданды және Image Lab Touch бағдарламалық құралы бар Bio-rad ChemiDoc MP Touch бейнелеу жүйесі арқылы визуалды түрде көрсетілді.
Рекомбинантты miniSOG-6xHis протеинін экспрессиялау және тазарту бұрын сипатталғандай орындалды.Қысқаша айтқанда, E. coli BL21(DE3) жасушалары (TransGen, #CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis көмегімен түрлендірілді және ақуыз экспрессиясы 0,5 мМ IPTG (Sangon, #A600168) көмегімен индукцияланды.Жасуша лизистен кейін ақуыздар Ni-NTA агароздық түйіршіктерді (MCE, № 70666) пайдаланып тазартылды, PBS-ге қарсы диализден өтті және –80°C температурада сақталды.
Антиденеге негізделген in vitro жапсырмаға жақындық талдауы үшін 100 мкм тазартылған miniSOG, 1 мМ зонд 3 және 1 мкг белгіге қарсы тінтуірдің моноклоналды антиденесін (TransGen, #HT501-01) PBS ішінде жалпы реакция көлемі 50 мкл болғанша араластырыңыз..Реакция қоспасы бөлме температурасында 0, 2, 5, 10 және 20 минут ішінде көк жарықдиодты шаммен сәулелендірілді.Қоспа 0,1 мМ биотин-PEG3-азидпен (Аладдин, #B122225), 1 мм TCEP, 0,1 мМ TBTA лигандымен және 1 мм CuSO4 бөлме температурасында 1 сағат бойы жоғары қозғалыстағы шайқағышта инкубацияланды.Жедел реакциядан кейін қоспаға 4x Лаэммли буферін тікелей қосып, 95°C температурада 10 минут қайнатыңыз.Үлгілер SDS-PAGE гельдерінде талданды және стрептавидин-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) бар вестерн блтинг арқылы талданды.
C-терминалды амидациясы бар гистидині бар синтетикалық пептид (LHDALDAK-CONH2) жақын маңдағы пептидтерге негізделген in vitro таңбалауды талдау үшін пайдаланылды.Бұл талдауда 100 мкМ тазартылған miniSOG, 10 mM зонд 3 және 2 мкг/мл синтетикалық пептид PBS-те 50 мкл жалпы реакция көлемінде араластырылды.Реакция қоспасы бөлме температурасында 1 сағат бойы көк жарықдиодты шаммен сәулелендірілген.Үлгінің бір микролитрі LC-MS жүйесі (Waters, MassLynx спектрін талдау бағдарламалық құралы бар SYNAPT XS иондарының ұтқырлық уақытының ұшу масс-спектрометрі) көмегімен талданды.
miniSOG синтез генін тұрақты экспрессиялайтын HEK293T жасушалары әртүрлі органеллалар локализациясы (Mito, ER, Nucleus) сызықтары үшін 10 см ыдыстарға және Parkin-miniSOG және BRD4-miniSOG желілері үшін 15 см табақтарға себілді.~90% қосылуға жеткенде, жасушалар HBSS-пен бір рет жуылды, содан кейін 37°C температурада 1 сағат бойы HBSS-те 3 зондпен инкубацияланды және бөлме температурасында 10 Вт көк жарық диодымен жарықтандырылды.Паркинді контактісіз таңбалау үшін HBSS ішіндегі 3 зондпен 10 мкМ протон-карбонил цианид тасымалдаушысы m-хлорфенилгидразон CCCP (Solarbio, #C6700) 37°C температурада 1 сағат бойы қосылды.Жасуша лизисі, шерту химиясы, қалпына келтіру және алкилдеу қадамдары жоғарыда сипатталғандай болды, тек 2 мг лизат қосылды және фотоыдырайтын биотин азидінің орнына шерту реакциясында биотин PEG3 азиді қолданылды.Байытқаннан кейін моншақтар 3 рет 0,2% SDS бар 5 мл PBS, 1 М мочевина бар 5 мл PBS 3 рет және 5 мл PBS бар 3 рет жуылды.Содан кейін ақуызды түнде 37°C температурада ыдырату үшін құрамында 1 М несепнәр бар 300 мкл 25 мм ABC-ге 2 мкг трипсин қосылды.Реакция рН 2-3 жеткенше құмырсқа қышқылын қосу арқылы тоқтатылды.Моншақтарда трипсинизациядан кейін пептид ерітіндісі SOLAµ HRP бағаны (Термо, №60209-001) арқылы тұзсыздандырылды және Speedvac вакуумдық концентраторында кептірілді.Пептидтер 0,1% құмырсқа қышқылында қайта ерітілді және 500 нг пептидтер жоғарыда сипатталған нано-ESI көзімен жабдықталған Orbitrap Fusion Lumos Tribrid масс-спектрометрінің көмегімен талданды.Пептидтер коммерциялық RP-HPLC бағандарында (75 мкм x 2 см) (Термо, н. 164946) және аналитикалық RP-HPLC бағандарында (75 мкм x 25 см) (Термо, н. 164941) бөлінген, екеуі де 2 мкм толтырылған.градиент 60 минут ішінде 8% -дан 35% ACN дейін, содан кейін 300 Нл/мин ағын жылдамдығында 6 минутта 98% B дейін сызықтық өсті.MS спектрлері (350-1500 м/ц) 60 000 рұқсатпен, AGC 4 × 105 және максималды енгізу уақыты 50 мс жиналды.Таңдалған иондар қалыпты соқтығысу энергиясы 30%, төрт полюсті оқшаулау терезесі 1,6 м/ц және 15000 рұқсатымен 3 секундтық циклде HCD арқылы дәйекті түрде фрагменттелді. 5 × 104 тандемдік масс-спектрометр AGC нысанасы және максималды енгізу уақыты 22 мс пайдаланылды.Динамикалық алып тастау 45 секундқа орнатылған. MS/MS үшін тағайындалмаған немесе заряды 1+ және >7+ иондар қабылданбады. MS/MS үшін тағайындалмаған немесе заряды 1+ және >7+ иондар қабылданбады. МС/МС үшін неназначенные ион немесе ион с зарядом 1+ және >7+ были отклонены. MS/MS үшін тағайындалмаған иондар немесе заряды 1+ және >7+ иондар қабылданбады.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 МС/МС үшін неуказанные ион немесе ион с зарядами 1+ және >7+ были отклоны. MS/MS үшін анықталмаған иондар немесе зарядтары 1+ және >7+ иондар қабылданбады.
NeutrAvidin моншақтарын байытуға дейінгі үлгіні дайындау қадамдары жоғарыда сипатталған LC-MS/MS талдауындағыдай болды.Жүктеуді бақылау үшін кіріс ретінде шамамен 50 мкг лизат пайдаланылды және 2 мг лизат басу реакциялары үшін пайдаланылды.Байыту және нейтравидинмен жуудан кейін байланысқан ақуыздар агарозды шайыр моншақтарына 50 мкл Лаэммли буферін қосу және 95°C температурада 5 минут қайнату арқылы элюцияланды.Бақылау жүктемесінің кірісі және моншақпен байытылған үлгілер SDS-PAGE арқылы талданды және стандартты Western Blot әдістерімен PVDF мембраналарына (Millipore, #ISEQ00010) тасымалданды.Мембраналар 0,1% твен-20 (TBST) бар TBS ішіндегі 5% майсыздандырылған сүтпен (Sangon, #A600669) бітеліп, бастапқы және қайталама антиденелермен дәйекті түрде инкубацияланды.Бастапқы антиденелер TBST-те 5% майсыздандырылған сүтте 1:1000 сұйылтылған және түні бойы 4°C температурада инкубацияланған.Екіншілік антиденелер 1:5000 қатынасында қолданылды және бөлме температурасында 1 сағат бойы инкубацияланды.Мембраналар Chemidoc MP бейнелеу жүйесі арқылы хемилюминесценция арқылы визуалды.Суреттегі дақтар мен гельдердің барлық кесілмеген сканерлеулері бастапқы деректер ретінде берілген.
Осы зерттеуде пайдаланылған негізгі антиденелер қоянға қарсы SFPQ моноклоналды антиденесін (CST, № 71992), қоянға қарсы FUS моноклонды антиденесін (CST, № 67840), қоянға қарсы NSUN2 поликлоналды антиденесін (Proteintech, № 20854-1-) қамтиды. AP), қоянға қарсы mSin3A поликлоналды антидене (Abcam, #ab3479), тінтуірдің тегке қарсы моноклональды антидене (TransGen, #HT201-02), тінтуірдің анти-β-актин моноклоналды антиденесі (TransGen, #HC201-01), қоянға қарсы антидене -CDK2 моноклоналды антиденесі (ABclonal, #A0094), қоянның CTBP1-ге моноклоналды антиденесі (ABclonal, #A11600), DUT-қа қоянның поликлоналды антиденесі (ABclonal, #A2901), қоянның PSMC4 (ABclonal, #A0094) антиденесі (ABclonal, #A2901), DNAJB1 поликлоналды антиденесі (ABclonal, № A5504).Бұл антиденелер TBST ішіндегі 5% майсыздандырылған сүтте 1:1000 сұйылтуда қолданылды.Осы зерттеуде пайдаланылған қайталама антиденелер 1:5000 сұйылту кезінде қоянға қарсы IgG (TransGen, #HS101-01), тышқанға қарсы IgG (TransGen, #HS201-01) болды.
BRD4-тің SFPQ-мен әрекеттесетінін әрі қарай зерттеу үшін HEK293T шамадан тыс экспрессиялайтын тұрақты HEK293T және BRD4-miniSOG жасушалары 10 см ыдыстарға салынды.Жасушалар салқын PBS-пен жуылды және 4°C температурада 30 минут бойы ЭДТАсыз протеаза ингибиторы бар 1 мл Pierce IP лизис буферінде (Термо Фишер, №87787) лизденді.Осыдан кейін лизаттар 1,5 мл центрифугалық түтіктерге жиналды және 4°C температурада 10 минут бойы 15,871 xg центрифугалады.Супернатант жиналды және 5 мкг анти-V5 таңбаланған тінтуірдің моноклоналды антиденесімен (CST, №80076) түнде 4°C температурада инкубацияланды.Құрамында 0,5% Tween-20 бар PBS бар шамамен 50 мкл протеиндік A/G магниттік түйіршіктерін (MCE, #HY-K0202) екі рет жуыңыз.Содан кейін жасуша лизаттары төменнен жоғарыға қарай айналдыра отырып, 4°C температурада 4 сағат бойы магниттік моншақтармен инкубацияланды.Содан кейін моншақтарды 1 мл PBST буферімен төрт рет жуып, 95°C температурада 5 минут қайнатады.Үлгілер SDS-PAGE гельдерінде талданды және стандартты Western Blot әдістерін пайдаланып PVDF мембраналарына ауыстырылды.Мембраналар TBST-те 5% майсыздандырылған сүтте бітеліп, бастапқы және қайталама антиденелермен дәйекті түрде инкубацияланды.Бастапқы антидене қоянының анти-SFPQ моноклоналды антиденесі (CST, #71992) TBST ішіндегі 5% майсыздандырылған сүтте 1:1000 қатынасында қолданылды және түні бойы 4°C температурада инкубацияланды.Қоянға қарсы IgG 1:5000 қатынасында қолданылды және бөлме температурасында 1 сағат бойы инкубацияланды.Мембраналар Chemidoc MP бейнелеу жүйесі арқылы хемилюминесценция арқылы визуалды.
Еріткіштерге қол жетімді беттік аумақты (SASA) талдау үшін пайдаланылатын барлық құрылымдар Протеин деректер банкінен (PDB)52 немесе AlphaFold протеин құрылымы дерекқорынан53 алынды.FreeSASA бағдарламасы арқылы әрбір қалдық үшін абсолютті SASA есептелді.Әрбір құрылым үшін орташа SASA мәнін алу үшін таңбаланған гистидин және оның көршілері үшін толық және бір мәнді SASA деректері ғана пайдаланылды.Әрбір гистидинге қатысты еріткіштің салыстырмалы қолжетімділігі (RSA) абсолютті SASA мәнін еріткіш үшін қол жетімді қалдық бетінің эмпирикалық максималды ықтимал ауданына бөлу арқылы есептелді.Содан кейін барлық гистидиндер, егер орташа RSA 20%-дан төмен болса, жасырын деп жіктелді, әйтпесе экспозиция56.
DDA режимінде алынған өңделмеген файлдар Proteome Discoverer (v2.5) немесе MSfragger (Fragpipe v15.0) көмегімен жалпы ластаушы заттар бар SwissProt тексерілген протеин дерекқорында ізделді.Пептидтер екі бөліну орны жоқ толық трипсинді, бекітілген модификация ретінде карбамоил метилденуін және динамикалық модификация ретінде метионинді тотығуды қажет етті.Прекурсор мен фрагмент салмағының төзімділіктері тиісінше 10 ppm және 0,02 Da (MS2 Orbitrap) орнатылды. Ластаушы заттар жойылды және <1% жалған табу жылдамдығын алу үшін белоктар сүзілді. Ластаушы заттар жойылды және <1% жалған табу жылдамдығын алу үшін белоктар сүзілді. Попадания загрязняющих веществ бұл удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного обнаружения <1%. Ластаушы заттар жойылды және <1% жалған анықтау жылдамдығын беру үшін ақуыздар сүзілді.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружений <1%. Ластаушы заттар жойылды және <1% жалған оң көрсеткішке жету үшін белоктар сүзілді.Белгілерді қолданбай сандық талдау үшін үш биологиялық қайталаудан алынған нормаланған ақуыз мазмұны пайдаланылды.Ақуыздың субклеткалық локализациясының талдауы DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 және Элис Тинг тобы құрастырған және жариялаған дерекқорлардан Gene Ontology (GO) талдауы арқылы орындалды.Жанартау картасы Персейден алынды (v1.6.15.0). Ақуыз көптігінің қатпарларының өзгерістері екі жақты t-сынағы арқылы статистикалық маңыздылық үшін сыналған және ақуыз соққылары молшылықтың өзгеруі >2 (егер басқаша көрсетілмесе) және p мәні <0,05 болатынымен анықталды. Ақуыз көптігінің қатпарларының өзгерістері екі жақты t-сынағы арқылы статистикалық маңыздылық үшін сыналған және ақуыз соққылары молшылықтың өзгеруі >2 (егер басқаша көрсетілмесе) және p мәні <0,05 болатынымен анықталды. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием екі t-критерия, және совпадения белков және идентифицирование изменением содержания> 2 (если не указано иное) и змечение <0, p <0, p. Ақуыз мазмұны қатпарларының өзгерістері екі жақты t-сынағы арқылы статистикалық маңыздылық үшін сыналған және ақуыз сәйкестіктері мазмұнның өзгеруі >2 (егер басқаша көрсетілмесе) және AP мәні <0,05 болатынымен анықталды.使用 双边 T 测试 测试 蛋白质 丰度 丰度 倍数 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化的, 并 确定 蛋白质 命 中 的 变化 变化的> 2 (除非 另另) 2 (除非除非 有 说明) 和 p 值 <0.05.Тіршілік ету Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) және p-значений <0,05. Ақуыз құрамындағы қатпар өзгерістерінің статистикалық маңыздылығы екі жақты t-сынағы арқылы сыналған және мазмұн өзгерістері >2 (егер басқаша көрсетілмесе) және p-мәндері <0,05 үшін ақуыз сәйкестігі анықталды.Ақуыздардың өзара әрекеттесу талдауы String дерекқорымен бірге GO талдауын қолдану арқылы орындалды.
Ұқсас нәтижелермен үш биологиялық қайталау жүргізілді.Статистикалық талдау GraphPad Prism (GraphPad бағдарламалық құралы) көмегімен жасалды және жанартау учаскелері Perseus (v1.6.15.0) көмегімен жасалды.Екі топты салыстыру үшін p-мәндері екі жақты Студенттің t-тесті арқылы анықталды.Тәжірибелік топта кем дегенде екі рет анықталған синглондық ақуыздар жанартау учаскелеріне қосылды және бақылау тобындағы сәйкес жетіспейтін мәндер p-мәнін есептеу үшін қалыпты таралудан Персейге ауыстырылды.Қате жолақтары орташа ± стандартты ауытқуды білдіреді.Статистикалық талдауға арналған протеомдық талдауларда кем дегенде екі биологиялық көшірмеде пайда болған ақуыздардың көптігі сақталды.Іріктеме көлемін алдын ала анықтау үшін статистикалық әдістер қолданылмаған.Тәжірибелер кездейсоқ емес.Зерттеушілер эксперимент және нәтижелерді бағалау кезінде тапсырмаларға соқыр болған жоқ.
Зерттеу дизайны туралы қосымша ақпарат алу үшін осы мақалаға сілтеме жасалған Табиғатты зерттеу есебінің аннотациясын қараңыз.
Осы зерттеуде алынған масс-спектрометриялық деректер ProteomeXchange консорциумына iProX57 серіктес репозиторийі арқылы ID PXD034811 деректер жинағы (PDPL-MS деректер жинағы) бойынша жіберілді.Шикі деректер бастапқы деректер файлдары түрінде беріледі.Бұл мақалада түпнұсқа деректер берілген.
Гинграс, AC, Abe, KT & Raught, B. Көршілес аймақпен танысу: ақуыз кешендерін және карта органеллаларын сипаттау үшін жақындыққа тәуелді биотинилденуді қолдану. Гинграс, AC, Abe, KT & Raught, B. Көршілес аймақпен танысу: ақуыз кешендерін және карта органеллаларын сипаттау үшін жақындыққа тәуелді биотинилденуді қолдану.Гинграс, AS, Abe, KT және Raut, B. Айналамен танысу: ақуыз кешендерін және карта органеллаларды сипаттау үшін жақындыққа тәуелді биотинилденуді қолдану. Гинграс, AC, Abe, KT & Raaught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并。 Гинграс, AC, Abe, KT & Raught, B. Көршілес аймақты түсіну: көршінің биологиялық өмірге тәуелділігін пайдаланыңыз.Гинграс, AS, Abe, KT және Raut, B. Жақындықты түсіну: протеиндік кешендерді сипаттау және жақындыққа тәуелді биотинилизацияны қолдану арқылы органеллаларды кескіндеу.Ағымдағы.Менің ойым.Химиялық.биология 48, 44–54 (2019).
Гери, Дж.Б. және т.б.Декстер энергиясын иммундық жасушаларға тасымалдау арқылы микроортаның картасын жасау.Ғылым 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Екі протеомды масштабты желілер адамның интерактомының жасушаға тән қайта құруын анықтайды.184, 3022–3040.e3028 ұяшықтары (2021).